NORMĂ nr. 0/2007

Articolul 1

Autoritatea veterinară centrală a României trebuie să solicite ca analizele efectuate în scopul controalelor oficiale pentru determinarea conținutului de vitamina A, vitamina E și triptofan al furajelor și premixurilor să fie efectuate folosindu-se metoda stabilită în anexa la prezenta normă sanitară veterinară.

Articolul 2

Autoritatea veterinară centrală a României informează Comisia Europeană cu privire la actele normative și prevederile administrative necesare pentru implementarea prezentei norme sanitare veterinare.

Articolul 3

Anexa face parte integrantă din prezenta normă sanitară veterinară.

Anexa

la norma sanitară veterinară

Partea A: Determinarea vitaminei A (retinol)

1. Scop și domeniu

Această metodă se folosește pentru determinarea vitaminei A (retinol) din furaje și premixuri. Vitamina A include toți compușii alcool trans-retinol și izomerii cis. Conținutul de vitamina A este exprimat în unități internaționale (UI)/kg. O unitate internațională corespunde activității a 0,300 æg a tuturor compușilor alcoolici trans ai vitaminei A sau 0,344 æg a tuturor compușilor acetați trans ai vitaminei A ori 0,550 æg a tuturor compușilor palmitați trans ai vitaminei A. Limita de determinare este de 2.000 UI vitamina A/kg. 2. Principiul metodei Proba este hidrolizată cu soluție etanolică de hidroxid de potasiu, iar vitamina A este extrasă în eter de petrol. Solventul este înlăturat prin evaporare, iar reziduul este diluat în metanol și, dacă este necesar, diluat până la concentrația necesară. Conținutul de vitamina A este determinat prin lichid cromatografie de înaltă performanță cu fază inversă (RP-HPLC), folosindu-se un detector cu UV sau cu fluorescentă. Parametrii cromatografici sunt aleși astfel încât să nu existe nicio diferență între toți compușii alcoolici trans ai vitaminei A și izomerii cis. 3. Reactivi: 3.1. Etanol, c = 96%, anhidru 3.2. Eter de petrol, interval de fierbere 40°-60°C 3.3. Metanol 3.4. Soluție de hidroxid de potasiu, â = 50 g/100 ml 3.5. Soluția de ascorbat de sodiu, â = 10 g/100 ml (a se vedea observațiile de la pct. 7.7) 3.6. Sulfit de sodiu, Na(2)S x H(2)O (x = 7-9) 3.6.1. Soluție de sulfit de sodiu, c = 0,5 mol/l în glicerol, â = 120 g/l (pentru x = 9) (a se vedea observațiile de la pct. 7.8) 3.7. Soluție de fenoftaleină, â = 2 g/100 ml în etanol (pct. 3.1) 3.8. 2-Propanol 3.9. Faza mobilă pentru HPLC: amestec de metanol (pct. 3.3) și apă, de exemplu 980

20 (v

v). Raportul exact trebuie determinat prin intermediul caracteristicilor coloanei folosite. 3.10. Azot, liber de oxigen 3.11. Acetat de vitamina A trans total, extrapur, cu activitate certificată, de exemplu 2,80 x 10^6 UI/g 3.11.1. Soluție stoc din vitamina A acetat trans total: se cântăresc, cu aproximație de 0,1 mg, 50 mg din acetat de vitamina A (pct. 3.11) într-un balon cotat de 100 ml. Se dizolvă în 2-propanol (pct. 3.8) și se completează până la semn cu același solvent. Concentrația nominală a acestei soluții este de 1.400 UI vitamina A/ml. Conținutul exact trebuie determinat în conformitate cu pct. 5.6.3.1. 3.12. Palmitat de vitamina A, extrapur, cu activitate certificată, de exemplu 1,80 x 10^6 UI/g 3.12.1. Soluție stoc din retinol palmitat trans total: se cântăresc, cu aproximație de 0,1 mg, 80 mg din palmitat de vitamina A (pct. 3.12) într-un balon cotat de 100 ml. Se dizolvă în 2-propanol (pct. 3.8) și se completează până la semn cu același solvent. Concentrația nominală a acestei soluții este de 1.400 UI vitamina A/ml. Conținutul exact trebuie determinat în conformitate cu pct. 5.6.3.2. 3.13. 2,6-di-tert-butil-4-metilfenol (BHT) (a se vedea observațiile de la pct. 7.5). 4. Aparatură: 4.1. Evaporator rotativ cu vacuum 4.2. Sticlărie brună 4.2.1. Baloane cu fund plat sau conice de 500 ml, cu șlif 4.2.2. Baloane cotate cu dopuri rodate, cu gât îngust, cu capacitate de 10, 25, 100 și 500 ml 4.2.3. Pâlnii de separare, conice, de 1.000 ml, cu dopuri din sticlă 4.2.4. Baloane piriforme din sticlă de 250 ml cu șlif 4.3. Condensator Allihn, de 300 mm, cu legătură din sticlă, cu adaptator pentru o pipă de aprovizionare cu gaz 4.4. Hârtie de filtru pentru separarea fazică, cu diametrul de 185 mm (de exemplu Schleicher & Schuell 597 HY(1/2) sau similar) 4.5. Lichid cromatografie de înaltă presiune (echipament HPLC cu sistem de injecție) 4.5.1. Coloană de lichid cromatografie, 250 mm x 4 mm, C(18), de 5 sau 10 æm sau echivalent (criteriu de performanță: doar un singur peak pentru toți izomerii retinolului în baza condițiilor HPLC) 4.5.2. Detector UV sau de fluorescentă, cu ajustare variabilă a lungimii de undă 4.6. Spectrofotometru cu cuve de cuarț de 10 mm 4.7. Baie de apă cu agitator magnetic 4.8. Aparat de extracție ce constă din: 4.8.1. Cilindru de sticlă cu capacitate de 1 l, echipat cu gât și dop rodat; 4.8.2. Mufă rodată, echipată cu un braț exterior și un tub ajustabil ce trece prin centru. Tubul ajustabil trebuie să aibă un capăt în formă de U în partea de jos și o parte efilată la partea opusă, astfel încât stratul superior de lichid din cilindru să poată fi transferat într-un tub de separare. 5. Procedură NOTĂ: Vitamina A este sensibilă la lumină (UV) și oxidare. Toate operațiunile trebuie efectuate în absența luminii (folosindu-se sticlărie brună sau sticlărie protejată cu folie de aluminiu) și a oxigenului (a se purja cu azot). În timpul extracției aerul de deasupra lichidului trebuie înlocuit cu azot (evitați presiunea în exces prin lărgirea dopului din când în când). 5.1. Pregătirea probei Se mărunțește proba astfel încât să treacă printr-o sită cu ochiuri de 1 mm, avându-se grijă să se evite generarea de căldură. Mărunțirea trebuie efectuată imediat înainte de cântărire și saponificare, altfel ar putea avea loc pierderi de vitamina A. 5.2. Saponificarea În funcție de conținutul de vitamina A, se cântăresc, cu aproximație de 0,01 g, 2 până la 25 g din probă, într-un balon de 500 ml cu fundul plat sau conic (pct. 4.2.1). Se adaugă în continuare, prin amestecare, 130 ml etanol (pct. 3.1), aproximativ 100 mg BHT (pct. 3.13), 2 ml soluție de ascorbat de sodiu (pct. 3.5) și 2 ml soluție de sulfit de sodiu (pct. 3.6). Se potrivește un condensator (pct. 4.3) la balon și se scufundă balonul într-o baie de apă cu agitator magnetic (pct. 4.7). Se încălzește până la fierbere și se lasă la reflux timp de 5 minute. Se adaugă apoi 25 ml soluție de hidroxid de potasiu (pct. 3.4) prin condensator (pct. 4.3) și se lasă la reflux timp de 25 de minute, agitându-se sub un flux ușor de azot. Apoi se clătește condensatorul cu aproximativ 20 ml apă și se răcește conținutul balonului la temperatura camerei. 5.3. Extracție Se transferă prin decantare întreaga soluție saponificată, prin clătire cu un volum total de 250 ml apă într-o pâlnie de separare de 1.000 ml (pct. 4.2.3) sau în aparatul de extracție (pct. 4.8). Se clătește balonul de saponificare în continuare cu 25 ml etanol (pct. 3.1) și 100 ml eter de petrol (pct. 3.2) și se transferă soluțiile de clătire în pâlnia de separare sau în aparatul de extracție. Proporția de apă și etanol în soluțiile combinate ar trebui să fie de 2:1. Se agită viguros timp de două minute și se lasă să se sedimenteze timp de două minute. 5.3.1. Extracție folosind un tub de separare (pct. 4.2.3) Când straturile de lichid s-au separat (a se vedea observația de la pct. 7.3), se transferă stratul de eter de petrol într-o altă pâlnie de separare (pct. 4.2.3). Se repetă această extracție de două ori, cu 100 ml eter de petrol (pct. 3.2) și de două ori cu 50 ml eter de petrol (pct. 3.2). Se spală extractele combinate în pâlnia de separare, de două ori, prin amestecare ușoară - pentru a se evita formarea emulsiilor - cu cantități de 100 ml apă și după agitare repetată alte cantități de 100 ml apă, până când apa rămâne incoloră la adăugarea soluției de fenoftaleină (pct. 3.7) - spălarea de patru ori este suficientă. Se filtrează extractul spălat printr-un filtru de hârtie pentru separare fazică (pct. 4.4), pentru a se înlătura orice cantitate de apă în suspensie, într-un balon cotat de 500 ml (pct. 4.2.2). Se spală pâlnia de separare și filtrul cu 50 ml eter de petrol (pct. 3.2), se umple până la semn cu eter de petrol (pct. 3.2) și se amestecă bine. 5.3.2. Extracție folosind un aparat de extracție (pct. 4.8) Când straturile s-au separat (a se vedea observația de la pct. 7.3), se înlocuiește dopul cilindrului de sticlă (pct. 4.8.1) prin inserție din sticlă mată (pct. 4.8.2) și se aranjează capătul de mai jos în formă de U al tubului ajustabil, astfel încât să se afle deasupra nivelului interfeței. Prin aplicarea unei presiuni de la generatorul de azot prin brațul exterior, se transferă stratul superior de eter de petrol într-un tub de separare de 1.000 ml (pct. 4.2.3). Se adaugă 100 ml eter de petrol (pct. 3.2) în cilindrul de sticlă (al aparatului), se atașează dopul și se agită bine. Se lasă straturile să se separe și se transferă stratul de deasupra în tubul de separare, la fel ca înainte. Se repetă procedura extracției cu încă 100 ml eter de petrol (pct. 3.2), apoi de două ori cu cantități de 50 ml eter de petrol (pct. 3.2) și se adaugă straturile de eter de petrol în tubul de separare. Se spală extractele combinate din eter de petrol, după cum este descris la pct. 5.3.1, și se procedează după cum este descris la acel punct. 5.4. Prepararea soluției probă pentru HPLC Se pipetează o cantitate alicotă din soluția de eter de petrol (de la pct. 5.3.1 la pct. 5.3.2) într-un balon în formă de pară de 250 ml (pct. 4.2.4). Se evaporă solventul până aproape de sec, la evaporatorul rotativ (pct. 4.1), cu presiune redusă, la o temperatură a băii de apă ce nu depășește 40°C. Se restabilește presiunea atmosferică prin admisie de nitrogen (pct. 3.10) și se îndepărtează balonul de pe evaporatorul rotativ. Se înlătură solventul rămas în curent de azot (pct. 3.10) și se dizolvă imediat reziduul cu un volum cunoscut (10-100 ml) de metanol (pct. 3.3) (concentrația de vitamina A trebuie să fie între 5 UI/ml și 30 UI/ml). 5.5. Efectuarea determinării prin HPLC Vitamina A este separată pe o coloană C(18) cu fază inversă (pct. 4.5.1), iar concentrația este măsurată printr-un detector de UV (325 nm) sau un detector de fluorescentă (excitație: 325 nm, emisie: 475 nm) (pct. 4.5.2). Se injectează o cantitate alicotă (de exemplu 20 æl) de soluție metanolică obținută conform pct. 5.4 și se eluează cu faza mobilă (pct. 3.9). Se calculează media peak-urilor înălțimii mai multor injecții din aceeași soluție de probă și media peak-urilor înălțimii mai multor injecții ale soluțiilor de calibrare (pct. 5.6.2). Condiții de separare HPLC Sunt oferite următoarele condiții pentru instruire; pot fi folosite alte condiții, cu obligația ca acestea să ofere rezultate echivalente. Coloana de lichid cromatografie (pct. 4.5.1): 250 mm x 4 mm, C(18) de 5 sau 10 æm ori echivalent Faza mobilă (pct. 3.9): amestec de metanol (pct. 3.3) și apă, de exemplu 980

20 (v

v) Rata de curgere: 1-2 ml/min. Detector (pct. 4.5.2): detector cu UV (325 nm) sau detector cu fluorescentă (excitație: 325 nm/emisie: 475 nm) 5.6. Calibrare 5.6.1. Prepararea soluțiilor standard de lucru Se pipetează 20 ml soluție stoc de acetat vitamina A (pct. 3.11) sau 20 ml soluție stoc de palmitat vitamina A (pct. 3.12.1) într-un balon cu fund plat sau conic (pct. 4.2.1) și se hidrolizează după cum este descris la pct. 5.2, dar fără a se adăuga BHT. Se aplică apoi extracția cu eter de petrol (pct. 3.2) în conformitate cu pct. 5.3 și se completează până la 500 ml cu eter de petrol (pct. 3.2). Se evaporă 100 ml din acest extract pe evaporatorul rotativ (a se vedea pct. 5.4) până aproape de sec, se înlătură solventul rămas cu un curent de azot (pct. 3.10) și se redizolvă reziduul în 10,0 ml metanol (pct. 3.3). Concentrația nominală a acestei soluții este 560 UI vitamina A/ml. Conținutul exact trebuie determinat în conformitate cu pct. 5.6.3.3. Soluția standard de lucru trebuie preparată proaspătă, înainte de folosire. Se pipetează 2,0 ml din această soluție standard de lucru, într-un balon cotat de 20 ml, se completează cu metanol până la semn (pct. 3.3) și se amestecă. Concentrația nominală a acestei soluții standard de lucru diluate este de 56 UI de vitamina A/ml. 5.6.2. Prepararea soluțiilor de calibrare și a graficului de calibrare: se transferă 1,0; 2,0; 5,0 și 10,0 ml din soluția standard de lucru, diluată într-o serie de baloane cotate de 20 ml, se completează până la semn cu metanol (pct. 3.3) și se amestecă. Concentrațiile nominale ale acestor soluții sunt 2,8; 5,6; 14,0 și 28,6 UI de vitamina A/ml. Se injectează 20 æl din fiecare soluție de calibrare de mai multe ori și se determină media înălțimilor peack-urilor. Folosindu-se media înălțimilor peack-urilor, se întocmește o curbă de calibrare, luându-se în considerare rezultatele obținute în UV (pct. 5.6.3.3). 5.6.3. Standardizarea UV a soluțiilor standard 5.6.3.1. Soluție stoc acetat de vitamina A Se pipetează 2,0 ml din soluția stoc acetat de vitamina A (pct. 3.11.1) într-un balon cotat de 50 ml (pct. 4.2.2) și se completează până la semn cu 2-propanol (pct. 3.8). Concentrația nominală a acestei soluții este de 56 UI vitamina A/ml. Se pipetează 3,0 ml din această soluție de acetat de vitamina A într-un balon cotat de 25 ml și se completează până la semn cu 2-propanol (pct. 3.8). Concentrația nominală a acestei soluții este de 6,72 UI vitamina A/ml. Se măsoară spectrul UV al acestei soluții față de 2-propanol (pct. 3.8) cu un spectrofotometru (pct. 4.6), la o lungime de undă între 300 nm și 400 nm. Extincția maximă trebuie să fie între 325 nm și 327 nm. Calcularea conținutului de vitamina A: UI vitamina A/ml = E(326) x 19,0 [E(1cm)^1% pentru vitamina A acetat = 1.530 la 326 nm în 2-propanol] 5.6.3.2. Palmitatul de vitamina A soluția stoc Se pipetează 2,0 ml de vitamina A palmitat din soluția stoc (pct. 3.12.1) într-un balon cotat de 50 ml (4.2.2) și se completează până la semn cu 2-propanol (pct. 3.8). Concentrația nominală a acestei soluții este de 56 UI vitamina A/ml. Se pipetează 3,0 ml din această soluție diluată de vitamina A palmitat într-un balon cotat de 25 ml și se completează până la semn cu 2-propanol (pct. 3.8). Concentrația nominală a acestei soluții este de 6,72 UI vitamina A/ml. Se măsoară spectrul UV al acestei soluții față 2-propanolului (pct. 3.8) cu spectrofotometrul (pct. 4.6) fixat la o lungime de undă între 300 nm și 400 nm. Extincția maximă trebuie să fie între 325 nm și 327 nm. Calcularea conținutului de vitamina A: UI vitamina A/ml = E(326) x 19,0 [E(1cm)^1% pentru vitamina A palmitat = 1.530 la 326 nm în 2-propanol] 5.6.3.3. Vitamina A = Soluție standard de lucru. Se pipetează 3,0 ml din soluția standard de vitamina A nediluată, preparată în conformitate cu pct. 5.6.1, într-un balon cotat de 50 ml (pct. 4.2.2) și se completează până la semn cu 2-propanol (pct. 3.8). Se pipetează 5 ml din această soluție într-un balon cotat de 25 ml și se aduce la semn cu 2-propanol (pct. 3.8). Concentrația nominală a acestei soluții este de 6,72 UI de vitamina A/ml. Se măsoară spectrul acestei soluții față de 2-propanol (pct. 3.8) cu spectrofotometrul (pct. 4.6) la lungime de undă între 300 nm și 400 nm. Extincția maximă trebuie să fie între 325 nm și 327 nm. Calcularea conținutului în vitamina A: UI vitamina A/ml = E(325) x 18,3 [E(1cm)^1% pentru retinol = 1.821 la 325 nm în 2-propanol] 6. Calcularea rezultatelor Pornindu-se de la înălțimea medie a peak-urilor de vitamina A a soluției de probă, se determină concentrația soluției de probă în UI/ml, prin referire față de curba de calibrare (pct. 5.6.2). Conținutul w de vitamina A în UI/kg al probei este dat de următoarea formulă: 500 x â x V(2)

w = ---------------- x 1.000 [UI/kg],

V(1) x m

în care: â = concentrația de vitamina A din soluția de probă (pct. 5.4) la UI/ml; V(1) = volumul soluției de probă (pct. 5.4), în ml; V(2) = volumul cantității alicote luate conform pct. 5.4, în ml; m = masa de probă luată în lucru, în g. 7. Observații 7.1. Pentru probe cu concentrație redusă de vitamina A poate fi util să se combine extractele de eter de petrol din două încărcături de saponificare (cantitate cântărită = 25 g) într-o soluție de probă pentru determinare HPLC. 7.2. Cantitatea probei utilizate pentru analiză nu ar trebui să conțină mai mult de 2 g grăsime. 7.3. Dacă separarea fazică nu are loc, adăugați aproximativ 10 ml etanol (pct. 3.1) pentru a întrerupe emulsia. 7.4. Pentru ulei din ficat de cod și alte grăsimi pure timpul de saponificare trebuie să fie extins la 45-60 de minute. 7.5. Poate fi folosită hidrochinonă în loc de BHT. 7.6. Folosindu-se o coloană fazică normală, este posibilă separarea de izomeri de retinol. 7.7. Se pot folosi aproximativ 150 mg de acid ascorbic în loc de soluție de ascorbat de sodiu. 7.8. Se pot folosi aproximativ 50 mg EDTA în loc de soluția de sulfit de sodiu. 8. Repetabilitate Diferența dintre rezultatele a două determinări paralele, efectuate pe aceeași probă, nu trebuie să depășească 15%, valoare relativă față de cel mai mare rezultat. 9. Rezultate ale unui studiu de colaborare*) ------ Notă

*) = Realizat de grupul de lucru pentru furaje din Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs-und Forschungsanstalten (VDLUFA)

Premix

Furaj

cu premix

Concentrat

mineral

Furaj

proteic

Purcel

L

13

12

13

12

13

n

48

45

47

46

49

medie

[UI/kg]

17,02 x 10^6

1,21 x 10^6

537.100

151.800

18.070

s(r)

[UI/kg]

0,51 x 10^6

0,039 x 10^6

22.080

12.280

682

r

[UI/kg]

1,43 x 10^6

0,109 x 10^6

61.824

34.384

1.910

CV(r)[%]

3,0

3,5

4,1

8,1

3,8

s(R)

[UI/kg]

1,36 x 10^6

0,069 x 10^6

46.300

23.060

3.614

R [UI/kg]

3,81 x 10^6

0,193 x 10^6

129.640

64.568

10.119

CV(R)

[%]

8,0

6,2

8,6

15

20

L: numar de laboratoare n: număr de valori singulare S(r): deviația standard a repetabilității s(R): deviația standard a reproductibilității r: repetabilitate R: reproductibilitate CV(r): coeficient de variație al repetabilității CV(R): coeficient de variație al reproductibilității Fig. 1. Aparatul de extracție (4.8.) NOTĂ(CTCE) Fig. 1. Aparatul de extracție (4.8.), se găsește în Monitorul Oficial al României, Partea I,

Nr. 147 din 28.02.2007, la pagina 6 (a se vedea imaginea asociată).

Partea B: Determinarea vitaminei E (tocoferol)

1. Scop și domeniu

Această metodă se folosește pentru determinarea vitaminei E din furaje și premixuri. Conținutul de vitamina E este exprimat ca mg de DL acetat de tocoferol/kg. Astfel, 1 mg DL acetat de tocoferol corespunde la 0,91 mg DL tocoferol (vitamina E). Limita de determinare este de 2 mg vitamina E/kg. 2. Principiu Proba este hidrolizată cu soluție de hidroxid de potasiu etanolic, iar vitamina E este extrasă în eter de petrol. Solventul este înlăturat prin evaporare, iar reziduul este dizolvat în metanol și, dacă este necesar, diluat până la concentrația necesară. Conținutul de vitamina E este determinat prin lichid cromatografie de înaltă performanță cu fază inversată (RP-HPLC), folosindu-se un detector cu fluorescentă sau UV. 3. Reactivi 3.1. Etanol, c = 96% 3.2. Eter de petrol, fracția 40°C - 60°C 3.3. Metanol 3.4. Soluție de hidroxid de potasiu, â = 50 g/100 ml 3.5. Soluție de ascorbat de sodiu, â = 10 g/100 ml (a se vedea observațiile de la pct. 7.7) 3.6. Sulfit de sodiu, Na(2)S x H(2)O (x = 7-9) 3.6.1. Soluție de sulfit de sodiu, c = 0,5 mol/l în glicerol, â = 120 g/l (pentru x = 9) (a se vedea observațiile de la pct. 7.8) 3.7. Soluție de fenolftaleină, â = 2 g/100 ml în etanol (pct. 3.1) 3.8. Faza mobilă pentru HPLC: amestec de metanol (pct. 3.3) și apă, de exemplu: 980

20 (v

v). Raportul exact trebuie să fie determinat prin intermediul caracteristicilor coloanei folosite. 3.9. Azot liber de oxigen 3.10. DL-α-tocoferol acetat, extrapur, cu activitate certificată 3.10.1. Soluție stoc din DL-α-acetat de tocoferol: se cântăresc, cu aproximație de 0,1 mg, 100 mg DL-α-acetat de tocoferol (pct. 3.10) într-un balon cotat de 100 ml. Se dizolvă în etanol (pct. 3.1) și se completează până la semn cu același solvent. Astfel, 1 ml din această soluție conține 1 mg DL-a-acetat de tocoferol (pentru control UV, a se vedea pct. 5.6.2.3; pentru stabilizare, a se vedea observațiile de la pct. 7.4) 3.11. DL-α-tocoferol, extrapur, cu activitate certificată 3.11.1. Se cântăresc, cu aproximație de 0,1 mg, 100 mg de DL-α-tocoferol (pct. 3.10) într-un balon gradat de 100 ml. Se dizolvă în etanol (pct. 3.1) și se completează până la semn cu același solvent. Astfel, 1 ml din această soluție conține 1 mg DL-α-tocoferol (pentru control UV, a se vedea pct. 5.6.2.3; pentru stabilizare, a se vedea observațiile de la pct. 7.4). 3.12. 2,6 di'adterț-butil-metilfenol (BHT) (a se vedea observațiile de la pct. 7.5). 4. Aparatură: 4.1. Evaporator rotativ cu vacuum 4.2. Sticlărie brună 4.2.1. Baloane cu fund plat sau conice de 500 ml, cu slif 4.2.2. Baloane cotate, cu dopuri rodate, cu gât strâmt, cu capacitate de 10, 25, 100 și 500 ml 4.2.3. Pâlnii de separare conice, de 1.000 ml, cu dopuri de sticlă 4.2.4. Baloane piriforme din sticlă de 250 ml cu gât rodat 4.3. Condensator Allihn, de 300 mm, cu legătură din sticlă, cu adaptator pentru o pipă de aprovizionare cu gaz 4.4. Hârtie de filtru pentru separare fazică, cu diametrul de 185 mm (de exemplu Schieicher & Schuell 597 HY 1/2 sau similar). 4.5. Echipament HPLC cu sistem de injecție 4.5.1. Coloana de lichid cromatografie, 250 mm x 4 mm, C(18), de 5 ori 10 æm sau echivalent 4.5.2. Detector UV sau de fluorescentă, cu ajustare variabilă a lungimii de undă 4.6. Spectrofotometru cu cuve de cuarț de 10 mm 4.7. Baie de apă cu agitator magnetic 4.8. Aparat de extracție constând în: 4.8.1. Cilindru de sticlă, de capacitate de 1 l, căruia i se pun un gât și dop de sticlă 4.8.2. Mufă din sticlă mată, echipată cu un braț exterior și cu un tub ajustabil ce trece prin centru. Tubul ajustabil trebuie să aibă un capăt în formă de U situat în partea de jos și un capăt efilat la partea opusă, astfel încât stratul superior de lichid din cilindru să poată fi transferat într-o pâlnie de separare. 5. Procedură NOTĂ: Vitamina E este sensibilă la lumină (UV) și oxidare. Toate operațiunile trebuie efectuate în absența luminii (folosindu-se sticlărie brună sau sticlărie protejată cu folie de aluminiu) și a oxigenului (a se spăla cu azot). În timpul extracției, aerul de deasupra lichidului trebuie înlocuit de azot (a se evita presiunea prin lărgirea dopului din când în când). 5.1. Pregătirea probei: se mărunțește proba astfel încât să treacă printr-o sită cu ochiuri de 1 mm, avându-se grijă să se evite generarea de căldură. Mărunțirea trebuie efectuată imediat înainte de cântărire și saponificare, altfel pot avea loc pierderi de vitamina E. 5.2. Saponificare: în funcție de conținutul de vitamina E, se cântăresc, cu aproximație de 0,01 g, 2 până la 25 g din probă într-un balon de 500 ml cu fundul plat sau conic (pct. 4.2.1). Se adaugă în continuare, prin amestecare, 130 ml etanol (pct. 3.1), aproximativ 100 mg BHT (pct. 3.12), 2 ml soluție de ascorbat de sodiu (pct. 3.5) și 2 ml soluție de sulfit de sodiu (pct. 3.6). Se potrivește un condensator (pct. 4.3) la balon și se scufundă balonul într-o baie de apă cu agitator mecanic (pct. 4.7). Se încălzesc până la fierbere și se lasă la reflux timp de 5 minute. Se adaugă apoi 25 ml soluție de hidroxid de potasiu (pct. 3.4) prin condensator (pct. 4.3) și se lasă la reflux timp de 25 de minute, agitându-se sub un flux ușor de azot. Apoi se clătește condensatorul cu aproximativ 20 ml apă și se răcește conținutul balonului la temperatura camerei. 5.3. Extracție: se transferă, prin decantare, întreaga soluție de saponificare, prin clătire cu un volum total de 250 ml apă, într~o pâlnie de separare de 1.000 ml, (pct.4.2.3) sau în aparatul de extracție (pct. 4.8). Se clătește balonul de saponificare, în continuare, cu 25 ml etanol (pct. 3.1) și 100 ml eter de petrol (pct. 3.2) și se transferă soluțiile de clătire în tubul de separare sau în aparatul de extracție. Proporția de apă și etanol în soluțiile combinate trebuie să fie 2:1. Se scutură viguros timp de două minute și se lasă să se sedimenteze timp de două minute. 5.3.1. Extracție folosind o pâlnie de separare (pct. 4.2.3); când straturile de lichid s-au separat (a se vedea pct. 7.3), se transferă stratul de eter de petrol într-o altă pâlnie de separare (pct. 4.2.3). Se repetă această extracție de două ori cu 100 ml eter de petrol (pct. 3.2) și de două ori cu 50 ml eter de petrol (pct. 3.2). Se spală extractele combinate din pâlnia de separare de două ori, prin amestecare ușoară (pentru a se evita formarea emulsiilor), cu cantități de 100 ml apă și după agitare repetată alte cantități de 100 ml apă, până când apa rămâne incoloră la adăugarea soluției de fenolftaleină (pct. 3.7) (spălarea de 4 ori este de obicei suficientă). Se filtrează extractul spălat printr~un filtru împăturit, pentru separare fazică (pct. 4.4), pentru a se înlătura orice cantitate de apă în suspensie, într-un balon cotat de 500 ml (pct. 4.2.2). Se spală pâlnia de separare și filtrul cu 50 ml eter de petrol (pct. 3.2), se umple până la semn cu eter de petrol (pct. 3.2) și se amestecă bine. 5.3.2. Extracție folosind un aparat de extracție (pct. 4.8); când straturile s-au separat (a se vedea observația de la pct. 7.3) se înlocuiește dopul cilindrului de sticlă (pct. 4.8.1) cu inserție din sticlă mată (pct. 4.8.2) și se aranjează capătul de jos în formă de U al tubului ajustabil, astfel încât să se afle deasupra nivelului interfeței. Prin aplicarea unei presiuni de la generatorul nitrogenului, prin brațul exterior, se transferă stratul superior de eter de petrol într-un tub de separare de 1.000 ml (pct. 4.2.3). Se adaugă 100 ml eter de petrol (pct. 3.2) în cilindrul de sticlă, se atașează dopul și se agită bine. Se lasă straturile să se separe și se transferă stratul de deasupra în tubul de separare ca și mai înainte. Se repetă procedura extracției cu încă 100 ml eter de petrol (pct. 3.2), apoi de două ori cu cantități de 50 ml eter de petrol (pct. 3.2) și se adaugă straturile de eter de petrol în tubul de separare. Se spală extractele combinate din eter de petrol, după cum este descris la pct. 5.3.1, și se procedează după cum este descris acolo. 5.4. Prepararea soluției probă pentru HPLC: se pipetează o cantitate alicotă din soluția de eter de petrol (de la pct. 5.3.1 la pct. 5.3.2) într-un balon în formă de pară, de 250 ml (pct. 4.2.4). Se evaporă solventul aproape de uscare pe evaporatorul rotativ (pct. 4.1) cu presiune redusă, la o temperatură a băii ce nu depășește 40°C. Se readuce la presiunea atmosferică prin admisie de azot (pct. 3.9) și se îndepărtează balonul de pe evaporatorul rotativ. Se înlătură solventul rămas printr-un curent de azot (pct. 3.9) și se dizolvă imediat reziduul cu un volum cunoscut (10-100 ml) de metanol (pct. 3.3) (concentrația de L-α-tocoferol trebuie să fie între 5 æ/ml și 30 æg/ml). 5.5. Determinare prin HPLC: vitamina E este separată pe o coloană cu fază inversată de C(18) (pct. 4.5.1), iar concentrația este măsurată printr-un detector de fluorescentă (excitație: 295 nm, emisie: 330 nm) sau un detector de UV (292 nm) (pct. 4.5.2). Se injectează o fracție alicotă (de exemplu: 20 æl) de soluție metanolică obținută conform pct. 5.4 și se realizează o eluție cu faza mobilă (pct. 3.8). Se calculează media înălțimii peak-ului mai multor injecții din aceeași soluție de probă și mediile înălțimii peak-ului ale mai multor injecții ale soluțiilor de calibrare (pct. 5.6.2). Condiții HPLC: Sunt oferite următoarele condiții pentru orientare; pot fi folosite alte situații, cu condiția ca acestea să ofere rezultate echivalente. Coloană de lichid cromatografic (pct. 4.5.1): 250 mm x 4 mm, C(18), ambalaje de 5 æm sau 10 æm sau echivalent Faza mobilă (pct. 3.8): amestec de metanol (pct. 3.3) și apă, de exemplu: 980

20 (v

v) Debit: 1-2 ml/min Detector (pct. 4.5.2): detector cu fluorescentă (excitație: 295 nm, emisie: 330 nm) sau detector de UV (292 nm) 5.6. Calibrare (DL acetat de tocoferol sau DL-α-tocoferol) 5.6.1. DL acetat de tocoferol standard de referință 5.6.1.1. Prepararea soluției standard de lucru Se transferă cu o pipetă 25 ml soluție de DL acetat de tocoferol (pct. 3.10.1) într-un balon de 500 ml cu fund plat sau conic (pct. 4.2.1) și se hidrolizează după cum este descris la pct. 5.2. Apoi se extrage cu eter de petrol (pct. 3.2), în concordanță cu pct. 5.3, și se completează până la 500 ml cu eter de petrol (pct. 3.2). Se evaporă 25 ml din acest extract pe evaporatorul rotativ (a se vedea pct. 5.4) până aproape de uscare, se înlătură solventul rămas cu un curent de azot (pct. 3.9) și se redizolvă reziduurile în 25,0 ml metanol (pct. 3.3). Concentrația nominală a acestei soluții este 45,5 æg DL-α-tocoferol/ml, echivalent cu 50 æg DL-α-tocoferol acetat/ml. Soluția standard de lucru trebuie preparată proaspătă, înainte de folosire. 5.6.1.2. Prepararea soluțiilor de calibrare sau a curbei de calibrare: se transferă 1,0, 2,0, 4,0 și 10,0 ml din soluția standard de lucru într-o serie de baloane gradate de 20 ml, se completează până la semn cu metanol (pct. 3.3) și se amestecă. Concentrațiile nominale ale acestor soluții sunt: 2,5; 5,0; 10,0 și 25,0 æg/ml DL-α-tocoferol acetat, de exemplu: 2,28, 4.55, 9,10 æg/ml și 22,8 æg/ml DL-α-tocoferol. Se injectează 20 æl din fiecare soluție de calibrare, de mai multe ori, și se determină media înălțimii peak-ului. Folosindu-se media înălțimilor peak-ului, se întocmește un grafic de calibrare. 5.6.1.3. Standardizarea UV a soluției de tocoferol acetat (pct. 3.10.1) Se dizolvă 5,0 ml soluție de tocoferol acetat (pct. 3.10.1) până la 25,0 ml cu etanol și se măsoară spectrul UV al soluției față de etanol (pct. 3.1) cu un spectrofotometru (pct. 4.6) la o lungime de undă între 250 nm și 320 nm. Absorbția maximă trebuie să fie la 284 nm: E(tcm)^1% = 43,6 la 284 nm în etanol La această dilutie trebuie obținută o valoare de extincție de 0,84 - 0,88. 5.6.2. DL-α-tocoferol standard de referință 5.6.2.1. Prepararea soluției standard de lucru Se transferă cu pipeta 2,0 ml soluție de tocoferol acetat (pct. 3.11.1) într-un balon cotat de 50 ml, se dizolvă în metanol (pct. 3.3) și se completează până la semn cu metanol. Concentrația nominală a acestei soluții este de 40 æg DL-α-tocoferol/ml, echivalent cu 44,0 æg de tocoferol acetat/ml. Soluția standard de lucru trebuie preparată proaspătă înainte de folosire. 5.6.2.2. Prepararea soluțiilor de calibrare și a graficului de calibrare Se transferă 1,0; 2,0; 4,0 și 10,0 ml din soluția standard de lucru diluată într-o serie de baloane cotate de 20 ml, se completează până la semn cu metanol (pct. 3.3) și se amestecă. Concentrațiile nominale ale acestor soluții sunt: 2,0; 4,0; 8,0 și 20,0 æg/ml și 22,0 æg/ml tocoferol acetat. Se injectează 20 æl din fiecare soluție de calibrare de mai multe ori și se determină mediile înălțimii peak-ului. Folosindu-se mediile înălțimii peak-ului, se întocmește un grafic de calibrare. 5.6.2.3. Standardizarea UV a soluției DL-α-tocoferol (pct. 3.11.1) Se dizolvă 2,0 ml până la 25,0 ml din soluția stoc de tocoferol (pct. 3.11.1) cu etanol (pct. 3.1) și se măsoară spectrul UV al acestei soluții față de etanol cu spectrofotometru (pct. 4.6) la lungime de undă între 250 nm și 320 nm. Absorbția maximă trebuie să fie la 292 nm: E(tcm)^1% = 75,8 la 292 nm în etanol. La această diluție trebuie obținută o valoare de extincție de 0,6. 6. Calcularea rezultatelor Pornindu-se de la media înălțimii peak-ului pentru vitamina E a soluției de probă, se determină concentrația soluției de probă în æg/ml (calculată ca α-tocoferol acetat) față de curba de calibrară (pct. 5.6.1.2 sau 5.6.2.2). Conținutul w de vitamina E în mg/kg de probă este dat de următoarea formulă: w = 500 X â X V(2) [mg/kg]/V(1) x m, în care: â = concentrația de vitamina E din soluția de probă (pct. 5.4) în UI/ml; V(1) = volumul soluției de probă (pct. 5.4), în æg/ml; V(2) = volumul cantității alicote folosite la pct. 5.4, în ml; m = masa porțiunii de testat, în g. 7. Observații 7.1. Pentru probe cu concentrație redusă de vitamina E poate fi util să se combine extractele de eter de petrol din două încărcături de saponificare (cantitate cântărită: 25 g) într-o soluție de probă, pentru determinare HPLC. 7.2. Masa probei utilizate pentru analiză nu ar trebui să conțină mai mult de 2 g grăsime. 7.3. Dacă separarea fazică nu are loc, se adaugă aproximativ 10 ml l etanol (pct. 3.1), pentru a întrerupe emulsia. 7.4. După măsurarea cu spectrofotometrul a soluției de tocoferol acetat sau DL-α-tocoferol, în conformitate cu pct. 5.6.1.3 sau 5.6.2.3, se adaugă aproximativ 10 mg BHT (pct. 3.12) la soluție (3.10.1 sau 3.10.2) și se păstrează soluția la frigider (perioadă de păstrare de maximum 4 săptămâni). 7.5. Poate fi folosită hidrochinona în loc de BHT. 7.6. Folosindu-se o coloană fazică normală, este posibilă separarea unui a-, â-, Y și tocoferol. 7.7. Se pot folosi aproximativ 150 mg acid ascorbic în loc de soluție de ascorbat de sodiu. 7.8. Se pot folosi aproximativ 50 mg EDTA în loc de soluție de sulfit de sodiu. 8. Repetabilitate Diferența dintre rezultatele a două determinări paralele, efectuate pe aceeași probă, nu trebuie să depășească 15%, valoare relativă față de cel mai mare rezultat. 9. Rezultatele unui studiu de colaborare*) ------ Notă

*) = Realizat de grupul de lucru pentru furaje din Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs-und Forschungsanstalten (VDLUFA)

Premix

Furaj

cu premix

Concentrat

mineral

Furaj

proteic

Purcel

L

12

12

12

12

12

n

48

48

48

48

48

medie

[UI/kg]

17380

1187

926

315

61,3

s(r)

[UI/kg]

384

45,3

25,2

13,0

2,3

r

[UI/kg]

1075

126,8

70,6

36,4

6,4

CV(r)[%]

2,2

3,8

2,7

4,1

3,8

s(R)

[UI/kg]

830

65,0

55,5

18,9

7,8

R [UI/kg]

2324

182,0

155,4

52,9

21,8

CV(R)

[%]

4,8

5,5

6,0

6,0

12,7

L: numar de laboratoare n: număr de valori singulare S(r): deviația standard a repetabilității s(R): deviația standard a reproductibilității r: repetabilitate R: reproductibilitate CV(r): coeficient de variație al repetabilității CV(R): coeficient de variație al reproductibilității Fig. 1. Aparatul de extracție (4.8.) NOTĂ(CTCE) Fig. 1. Aparatul de extracție (4.8.), se găsește în Monitorul Oficial al României, Partea I,

Nr. 147 din 28.02.2007, la pagina 10 (a se vedea imaginea asociată).

Partea C: Determinarea triptofanului

1. Scop și domeniu

Această metodă se folosește pentru determinarea cantității totale și libere de triptofan din furaje. Nu se face distincție între formele D și L. 2. Principiu Pentru determinarea triptofanului total, proba este hidrolizată în condiții alcaline cu soluție saturată de hidroxid de bariu și încălzită la 110°C, pentru 20 de ore. După hidroliză se adaugă standardul intern. Pentru determinarea triptofanului liber proba este extrasă în condiții de aciditate ușoară, în prezența standardului intern. Triptofanul și standardul intern din hidrolizat sau din extract sunt determinate prin HPLC cu detector cu fluorescentă. 3. Reactivi 3.1. Trebuie folosită apă bidistilată sau apă de calitate echivalentă (conductivitate < 10 æS/cm) 3.2. Substanța standard: triptofan (puritate/conținut > 99%), uscată sub vacuum pe pentoxid de fosfor 3.3. Substanță standard intern: a-metil-triptofan (puritate/conținut > 99%), uscată sub vacuum pe pentoxid de fosfor 3.4. Hidroxid de bariu octahidrat [trebuie avut grijă pentru a nu se expune Ba(OH)(2) x 8H(2)O excesiv la aer, pentru a se evita formarea de BaCO(3) ce ar putea afecta determinarea] (a se vedea observația de la pct. 9.3) 3.5. Hidroxid de sodiu 3.6. Acid ortofosforic, w = 85% 3.7. Acid clorhidric, 20 = 1,19 g/ml 3.8. Metanol, grade HPLC 3.9. Eter de petrol, domeniu de fierbere 40-60°C 3.10. Soluție de hidroxid de sodiu, c = 1 mol/l Se dizolvă 40,0 g NaOH (pct. 3.5) în apă și se completează cu apă până la 1 l (pct. 3.1) 3.11. Acid clorhidric, c = 6 mol/l. Se iau 492 ml HCL (pct. 3.7) și se completează cu apă până la 1 l. 3.12. Acid clorhidric, c = 1 mol/l. Se iau 82 ml HCL (pct. 3.7) și se completează cu apă până la 1 l. 3.13. Acid clorhidric, c = 0,1 mol/l. Se iau 8,2 ml HCL (pct. 3.7) și se completează cu apă până la 1 l. 3.14. Acid ortofosforic, c = 0,5 mol/l. Se iau 34 ml acid ortofosforic (pct. 3.6) și se completează cu apă până la 1 l (pct. 3.1). 3.15. Soluție concentrată de triptofan (pct. 3.2), c = 2,50 mol/ml: într-un balon cotat de 500 ml se dizolvă 0,2553 g triptofan (pct. 3.2) în acid clorhidric (pct. 3.13) și se completează până la semn cu acid clorhidric (pct. 3.13). Se depozitează la -18°C pentru maximum 4 săptămâni. 3.16. Soluție concentrată standard intern, c = 2,50 æmol/ml. Într-un balon cotat de 500 ml se dizolvă 0,2728 g a-metil-triptofan (pct. 3.3) în acid clorhidric (pct. 3.13) și se completează până la semn cu acid clorhidric (pct. 3.13). Se depozitează la -18°C pentru maximum 4 săptămâni. 3.17. Soluție de triptofan standard de calibrare și standard intern: se iau 2,00 ml soluție concentrată de triptofan (pct. 3.15) și 2,00 ml soluție standard intern concentrat (a-metil-triptofan) (pct. 3.16). Se diluează cu apă (pct. 3.1) și metanol (pct. 3.8) cu aproximativ același volum și până la aproximativ aceeași concentrație de metanol (10-30%) ca și hidrolizatul final finisat. Soluția standard trebuie să fie proaspăt preparată înainte de folosire. 3.18. Acid acetic 3.19. 1,1,1-tricloro-2-metil-2-propanol 3.20. Etanolamină > 98% 3.21. Soluție de 1 g - 1,1,1-tricloro-2-metil-2-propanol (pct. 3.19) în 100 ml metanol 1% (pct. 3.8) 3.22. Fază mobilă pentru HPLC: 3,00 g acid acetic (pct. 3.18)

900 ml apă (pct. 3.1)

50,0 ml soluție (pct. 3.21) de 1,1,1-tricloro-2-metil-2-propanol (pct. 3.19) în metanol (pct. 3.8) (1 g/100 ml). Se ajustează pH-ul la 5,00, folosindu-se etanolamină (pct. 3.20). Se completează până la 1.000 ml cu apă (pct. 3.1). 4. Aparatură 4.1. Echipament HPLC cu un detector spectrofluorimetric 4.2. Coloană de lichid cromatografie, 125 mm x 4 mm, C(18), în ambalaje de 3 æm sau echivalent 4.3. pH-metru 4.4. Balon de polipropilenă, capacitate 125 ml, cu gât larg și dop cu șurub 4.5. Membrană filtrantă, 0,45 æm 4.6. Autoclav sau etuvă cu vid 110(±2)°C,1,4(±0,1) bar. 4.7. Agitator mecanic sau agitator magnetic 4.8. Agitator vortex 5. Procedură 5.1. Prepararea probelor Proba trebuie să treacă printr-o sită de 0,5 mm. Probele cu umiditate ridicată trebuie să fie uscate în aer, la o temperatură ce nu depășește 50°C, sau uscate cu gheață, înainte de mărunțire. Probele cu conținut ridicat de grăsimi trebuie extrase cu eter de petrol (pct. 3.9) înainte de mărunțire. 5.2. Determinarea triptofanului liber (extract) Se cântărește, cu aproximație de 1 mg, o cantitate de probă (1-5 g) (pct. 5.1) într-un balon conic. Se adaugă 100,0 ml acid clorhidric, c = 0,1 mol/l (pct. 3.13) și 5,00 ml din soluție standard internă concentrată (pct. 3.16). Se agită sau se amestecă timp de 60 de minute, folosindu-se un agitator mecanic sau un agitator magnetic (pct. 4.7). Se permite sedimentului să se depună și se pipetează 10,0 ml din soluția de supernatant într-un pahar de laborator. Se adaugă 5 ml acid ortofosforic, c = 0,5 mol/l. Se ajustează pH-ul la 3,0 folosind hidroxid de sodiu, c = 1,0 mol/l. Se adaugă suficient metanol (pct. 3.8) pentru a se realiza o concentrație între 10 și 30% de metanol volum final. Se transferă într-un balon cotat de volum corespunzător și se diluează cu apă până la un volum necesar pentru cromatografie [aproximativ același volum ca și soluția de calibrare standard (pct. 3.17)]. Se filtrează câțiva ml de soluție printr-un filtru de membrană de 0,45 æm (pct. 4.5), înaintea injectării pe coloana HPLC. Se trece la etapa cromatografiei, în conformitate cu pct. 5.4. Se protejează soluția standard și extrasele față de lumina directă a soarelui. Dacă nu este posibil să se analizeze extractele în aceeași zi, acestea pot fi păstrate la 5°C pentru maximum 3 zile. 5.3. Determinarea triptofanului total (hidrolizat) Se cântărește cu aproximație 0,2 mg, de la 0,1 la 1 g din proba preparată (pct. 5.1), în balonul de propilenă (pct. 4.4). Cantitatea de probă cântărită trebuie să aibă un conținut de azot de 10 mg. Se adaugă 8,4 g de octahidrat de hidroxid de bariu (pct. 3.4) și 10 ml de apă. Se amestecă cu un agitator vortex (pct. 4.8) sau cu un agitator magnetic (pct. 4.7). Se lasă magnetul acoperit cu teflon, în amestec. Se spală pereții vasului cu 4 ml de apă. Se pune dopul cu șurub și se închide ușor balonul. Se transferă într-o autoclavă (pct. 4.6) cu apă ce fierbe și se lasă la aburi pentru 30-60 de minute). Se închide autoclava și se realizează autoclavare la 110(^

2)°C pentru 20 de ore. Înaintea deschiderii autoclavei se reduce temperatura până la 100°C. Pentru a evita cristalizarea Ba(OH)(2) x 8H(2)O, se adaugă la amestecul cald 30 ml de apă la temperatura camerei. Se scutură sau se agită ușor. Se adaugă 2,00 ml soluție standard intern concentrată (de a-metil-triptofan) (pct. 3.16). Se răcesc paharele pe baie de apă timp de 15 minute. Se adaugă apoi 5 ml de acid ortofosforic, c = 0,5 mol/l (pct. 3.14). Se păstrează vasul la baia de răcire și se neutralizează cu HCl, c = 6 mol/l (pct. 3.11) în timp ce se agită și se ajustează pH-ul la 3,0 folosindu-se HCl, c = 1 mol/l (pct. 3.12). Se adaugă suficient metanol pentru a se realiza o concentrație între 10 și 30% de metanol în volumul final. Se transferă într-un balon cotat de volum corespunzător și se diluează cu apă până la semn, necesar pentru cromatografie (de exemplu 100 ml). Adăugarea de metanol nu trebuie să ducă la apariția precipitatului. Se filtrează câțiva ml din soluție printr-un filtru de membrană de 0,45 æm (pct. 4.5) înaintea injectării pe coloana HPLC, se trece la etapa cromatografiei, în conformitate cu pct. 5.4. Se protejează soluția standard și hidrolizatele față de lumina directă a soarelui. Dacă nu este posibil să se analizeze hidrolizatele în aceeași zi, acestea pot fi depozitate la 5°C, pentru maximum 3 zile. 5.4. Determinare prin HPLC Sunt oferite pentru instruire următoarele condiții de eluție isocratică; pot fi folosite alte situații, cu condiția ca acestea să ofere rezultate echivalente (a se vedea, de asemenea, observațiile de la pct. 9.1 și 9.2). Coloana de lichid cromatografie (pct. 4.2): 125 mm x 4 mm, C(18), ambalaj de 3 æm. Temperatura coloanei: temperatura camerei. Faza mobilă (pct. 3.22): 3,00 g acid acetic apă (pct. 3.1)

50,0 ml soluție (pct. 3.21) de 1,1,1-tricloro-2-metil-2-propanol (pct. 3.19) în metanol (pct. 3.8) (1 g/100 ml). Se ajustează pH-ul la 5,00, folosindu-se etanolamină (pct. 3.20). Se completează până la 1.000 ml cu apă [pct. 3.1; de exemplu: 980

20 (v

v)]. Debitul: 1 ml/min. Timpul total de funcționare: aproximativ 34 minute. Detecția la lungimea de undă: excitație: 280 nm, emisie: 356 nm. Volumul de injecție: 20 æl 6. Calcularea rezultatelor

A x B x C x D x E x MW ---------------------- = g triptofan/ 100 g probă, unde:

F x G x H x 10000 x W

A = zona peak-ului pentru standardul intern, soluție standard de calibrare ( pct. 3.17); B = zona peak-ului triptofanului, extract (pct. 5.2) sau hidrolizat (pct. 3.3); C = volumul, în ml (2 ml), al soluției de triptofan concentrat (pct. 3.15) adăugat soluției de calibrare (pct. 3.17); D = concentrația, în/æmol/ml (= 2,50), din soluția de triptofan concentrat (pct. 3.15) adăugată soluției de calibrare (pct. 3.17); E = volumul, în ml, al soluției concentrate standard intern (pct. 3.16), adăugată la extract (pct. 5.2) (= 5,00 ml) sau hidrolizat (pct. 5.3) (= 2,00 ml); F = zona peak-ului pentru standardul intern, extract (pct. 5.2) sau hidrolizat (pct. 5.3); G = zona peak-ului triptofanului, soluție standard de calibrare (pct. 3.17); H = volumul în ml (= 2,00) al soluției standard intern concentrată (pct. 3.16), adăugată la soluția standard de calibrare (pct. 3.17); W = greutatea probei în g (corectată la greutatea originală, dacă este uscată și/sau degresată); MW = greutatea moleculară a triptofanului (= 204,23). 7. Repetabilitate Diferența dintre rezultatele a două determinări paralele, efectuate pe aceeași probă, nu trebuie să depășească 10% valoare relativă față de cel mai mare rezultat. 8. Rezultate ale unui studiu de colaborare A fost realizat un studiu de colaborare la nivelul comunitar (a patra intercomparație) în cadrul căruia s-au analizat 3 probe, de către 12 laboratoare, pentru a certifica metoda pentru hidroliză. Au fost efectuate 5 replicate din fiecare probă. Rezultatele sunt oferite de tabelul următor:

Proba 1

Furaj

pentru

porcine

Proba 2

Furaj pentru

porcine suplimentat

cu L-triptofan

Proba 3

Concentrat

de furaj

pentru porcine

L

12

12

12

N

50

55

50

medie [g/kg]

2,42

3,40

4,22

S(r)[g/kg]

0,05

0,05

0,08

r[g/kg]

0,14

0,14

0,22

CV(r)[%]

1,9

1,6

1,9

s(R)[g/kg]

0,15

0,20

0,09

R[g/kg]

0,42

0,56

0,25

CV(R)[%]

6,3

6,0

2,2

L: numar de laboratoare n: număr de valori singulare S(r): deviația standard a repetabilității S(R): deviația standard a reproductibilității r: repetabilitate R: reproductibilitate CV(r): coeficient de variație al repetabilității CV(R): coeficient de variație al reproductibilității A fost realizat un alt studiu de colaborare la nivelul comunitar (a treia intercomparație) în cadrul căruia s-au analizat două probe de către 13 laboratoare, pentru a se certifica metoda de extracție pentru triptofanul liber. Au fost efectuate analize replicate (5) din fiecare probă. Rezultatele sunt oferite de tabelul următor:

Proba 4

Amestec de grâu

și soia

Proba 5

Amestec de grâu și

soia (= proba 4)

cu triptofan adăugat

(0,457 g/kg)

L

12

12

N

55

60

medie [g/kg]

0,391

0,931

S(r)[g/kg]

0,005

0,012

r[g/kg]

0,014

0,034

CV(r)[%]

1,34

1,34

s(R)[g/kg]

0,018

0,048

R[g/kg]

0,050

0,134

CV(R)[%]

4,71

5,11

L: numar de laboratoare n: număr de valori singulare S(r): deviația standard a repetabilității S(R): deviația standard a reproductibilității r: repetabilitate R: reproductibilitate CV(r): coeficient de variație al repetabilității CV(R): coeficient de variație al reproductibilității A fost realizat un alt studiu de colaborare la nivel comunitar, în cadrul căruia s-au analizat 4 probe de către 7 laboratoare, cu scopul unei certificări a triptofanului prin hidroliză. Rezultatele sunt oferite mai jos. Analize replicate (5) au fost efectuate pe fiecare probă.

Proba 1

Furaj

amestecat

pentru

porcine

(CRM 117)

Proba 2

Hrană pentru

pește, cu

nivel scăzut

de grăsime

(CRM 118)

Proba 3

Hrană din

soia-fasole

(CRM 119)

Proba 4

Pudră de

lapte

ecremat

(CRM 120)

L

7

7

7

7

N

25

30

30

30

medie [g/kg]

2,064

8,801

6,882

5,236

S(r)[g/kg]

0,021

0,101

0,089

0,040

r[g/kg]

0,059

0,283

0,249

0,112

CV(r)[%]

1,04

1,15

1,30

0,76

s(R)[g/kg]

0,031

0,413

0,283

0,221

R[g/kg]

0,087

1,156

0,792

0,619

CV(R)[%]

1,48

4,69

4,11

4,22

L: numar de laboratoare n: număr de valori singulare S(r): deviația standard a repetabilității S(R): deviația standard a reproductibilității r: repetabilitate R: reproductibilitate CV(r): coeficient de variație al repetabilității CV(R): coeficient de variație al reproductibilității 9. Observații 9.1. Folosirea unor condiții cromatografice speciale poate crea o mai bună separare între tiptofan și a-metil-triptofan. Eluție isocratică urmată de spălarea gradientului de coloană lichid cromatografie cu: 125 mm x 4 mm, C(18), ambalaje de 5 æm sau echivalent. Temperatura coloanei: 32°C

Faza mobilă:

A: 0,01 mol/KH(2)PO(4)/metanol, 95

5 (V

V) 1

B: Metanol

Program gradient: 0 min.

. 100% A 0% B 15 min.

. 100% A 0% B 17 min.

. 60% A 40% B 19 min.

. 60% A 40% B 21 min.

. 100% A 0% B 33 min.

. 100% A 0% B

Debit: 1,2 ml/min. Timpul total de separare: aproximativ 33 de minute 9.2. Cromatografia variază în concordanță cu tipul de HPLC și de materialul de împachetare a coloanei folosit. Sistemul ales trebuie să fie capabil să ofere o separare de bază între tiptofan și standardul intern. Mai mult, este important ca produsele de degradare să fie bine separate de triptofan și de standardul intern. Hidrolizatele fără standard intern trebuie testate pentru a se verifica linia de bază pentru impurități sub standardul intern. Este important ca timpul de achiziție să fie suficient de lung pentru eluția tuturor produselor de degradare, altfel pot interfera limite cu eluție târzie cu utilizări cromatografice ulterioare. În domeniul funcționării sistemul de cromatografie trebuie să ofere răspuns linear. Răspunsul linear trebuie măsurat cu o concentrație constantă (normală) a standardului intern și a concentrațiilor variate de triptofan. Este important și faptul că mărimea atât a peak-urilor triptofanului, cât și a peak-urilor standardelor interne este cuprinsă în domeniul linear al sistemului HPLC/fluorescență. Dacă peak-ul triptofanului și/sau al standardului intern este prea mic sau ridicat, analiza trebuie repetată cu o altă cantitate de probă și/sau cu un volum final schimbat. 9.3. Hidroxid de bariu Cu timpul hidroxidul de bariu devine mai dificil de dizolvat. Aceasta duce la o soluție neclară pentru determinarea HPLC ce poate produce rezultate scăzute pentru triptofan.