ANEXĂ nr. 0/2003

ANEXA

Nr. 1

1. In baza articolului 1 al prezentului Ordin se aplica urmatoarele conditii generale: - natura si obiectivele activitatilor pentru care este introdus sau deplasat materialul trebuie sa fie examinate de catre organismul oficial responsabil si gasite in conformitate cu conceptul de experienta, scop stiintific, sau experimental si lucr ri pe selectii varietale prevazute in Hotararea de Guvern numarul 1030/2001 privind masurile de protectie împotriva introducerii si raspandirii organismelor de carantina daunatoare plantelor sau produselor vegetale in Romania; - Conditiile de carantina a unitatilor si instalațiilor de la locul sau locurile in care se desfasoara activitatile sunt inspectate de catre organismul oficial responsabil pentru a fi in conformitate cu prevederile de la punctul 2, - Organismul oficial responsabil limiteaza cantitatea de 1naterial importat la un nivel corespunzaror activitatilor aprobate, fara a se depasi capacitatea instalatiilor de carantina disponibile)' - Calificarea stiintifica si tehnica a personalului prin care se desfaroara activitatile" trebuie sa fie verificata si aprobata de catre organismul oficial responsabil.

2. In baza punctului 1, conditiile de carantina a unitatilor s1 instalatiilor de la locul sau locurile de desfasurare a activitatilor trebuie sa fie suficiente pentru a asigura manipularea în siguranta a n1aterialului, astfel incat sa fie eliminat riscul raspandirii organismelor daunatoare.

Pentru fiecare activitate specificata in cerere, organismul oficial responsabil determina riscul raspandirii organismelor daunatoare tinute in conditii de carantina, tinand cont de natura materialului si de activitatea-avuta-în vedere, de biologia organismului daunator, de mijloacele de raspandire, de interactiunea cu mediul si de ceilalti factori relevanti legati de riscul prezentat de material.

A. Ca rezultat al evaluarii riscului, organismul oficial responsabil ia in calcul si stabileste, dupa caz, unnatoarele masuri de carantina privind unitatile, instalatiile si procedurile de lucru:

a) izolarea fizica a organismelor daunatoare de orice alt material, inclusiv controlul vegetatiei din zonele inconjuratoare;

b) desemnarea unei persoane de contact responsabila cu activitatile;

c) accesul limitat in unitati si instalatii precum si in zona inconjuratoare, dupa caz, numai pentru personalul numitJ

d) identificarea unitatilor si instalatiilor corespunzatoare, indicand tipul activitatilor si personalul autorizat,'

e) pastrarea unui registru al activitatilor desfasurate si a unui manual cu procedurile de operare, incluzand procedurile in cazul scaparii organismelor daunatoare din carantina;

f) sisteme adecvate de securitate si alarma;

g) masuri de control adecvate pentru prevenirea introducerii si a raspandirii organismelor daunatoare in unitati,

h) proceduri de control pentru esantionarea si transferul materialului intre unitati si instalatii;

i) controlul eliminarii deseurilor, solului si apei;dupa caz;

j) proceduri si instalatii adecvate de igiena si dezinfectie pentru personal, unitati si echipament;

k) masuri si instalatii adecvate pentru eliminarea riscului prezentat de materialul experimental; 1) proc · eduri si instalatii de indexare adecvate (incluzand testarea) si

B. Masuri de carantina suplimentare conforme cu biologia specifica si epidemiologia tipului de material implicat in activitatile aprobate:

a) pastrarea in instalatii, in camere speciale, unde accesul personalului se face prin usi duble;

b) pastrarea in spatii cu presiune negativa;

c) izolarea in containere prevazute cu pereti din plasa, cu ochiuri de dimensiuni corespunzatoare si alte bariere, de exemplu baraje lichide pentru acarieni, containere cu sol pentru nematozi, capcane electrice pentru insecte;

d) pastrarea in conditii de izolare de alte organisme daunatoare si de alte materiale infestate, de exemplu: substratul in care au crescut plantele atacate, plantele gazda atacate;

e) pastrarea materialului pentn1 inmultire in custi de inmultire cu mecanisme de manipulare;

f) evitarea incrucisarii organismelor daunatoare cu tulpini sau specii indigene;

g) evitarea cresterii permanente a organismelor daunatoare,'

h) pastrarea in conditii prin care se controleaza strict multiplicarea organismelor daunatoare, de exemplu într-un mediu de inhibare a diapauzei,

i) pastrarea in asa fel incat sa nu aiba loc raspandirea pnn n1ijloace de propagare'.) de exemplu,

evitarea curentilor de aer

j) proceduri de verificare a puritatii culturilor de organisme daunatoare pentru a le pastra libere de paraziti si alte organisme daunatoare,L

k) program adecvat de control al materialului pentn1 a elimina posibilii vectori:

I)

pentru activitatile in vitro,manevrarea materialului in conditii sterile: echiparea laboratorului pentru executarea procedurilor 1n conditii aseptice/

m) pastrarea organismelor, care se raspandesc prin vectori, in conditii care sa previna raspandirea prin intermediul vectorilor, de exemplu folosirea de plase cu ochiuri de dimensiuni controlate, izolarea solului

n) izolarea în functie de sezon J astfel incat activitatile sa fie efectuate in perioadele cu risc fitosanitar scazut.

ROMANI.A §ClU§OARE DE AUTORIZARE JLJETTER OF AUTHORITY

1. Numele și adresa expeditorului/ Organizatia de protectia plantelor din tara de origine

Name and address of the consignor/ Plant protection organization ofthe country of origin §cirnimă!lll"l!l ttlle ă!ll!R\torn7llllll"l!l

JP'enntru filllltll"ottllllllcewean și/smun llJlll!llD.illll"l!lă!l nJIB cii!l"clll!Ilă!lție ă!l orglllllllB!i!lllBl!llloll" diiilllll!Riiiltoiure, pllmnntelloll", pwo«!lMsellow vegetl!l lle !iă!lllil ă11rlk0Beloll" iregDemmeJIB1tl!l1te pei!ll1tnn iei.perieJID.1te, scopuri ștnințilf'ke Slll111l upewimmeDl!ta!Be șii pei!ll1tll"IIH IWicll"inri pe selec ni vă!lri.e1tă!llle !Le11:11:ew olt' l!lllllttllnoll"âfy !Foir 1tllne iinnttirottll11Hdn®D11 lllnn«ll/ow mmovemmellll1t olt'11:ni!llrmmlt'lll!Il oirgallllii!imms, JP1IlH1ts, JPilă!ll!l.1t pir@dllllcts ă!lllllirll 01tllne1r olojects

foir 1t!l"ălllll llllir

sde1111\tnll'k ]PnRlrjpl®§(!l§ Hilll foir woirlk ®Hll

VlllllllrHl!l1tail seilednlOillll§

2. Numele ș i adresa persoanei competente pentru activitățile aprobate/ Name and address of the person responsible for the aapproved aactivities: 3. Numele organului oficial competent / Name of the responsible official body:

4. Adresa și descrierea locului sau locurilor specifice pentru detinerea în carantină/ Address and description of the specific site or sites for quarantine containement:

5. Locul de origine (dovada documentară anexată pentru materialele originare dintr-o alta țară)/ Place of origin ( documentary evidence attached for material originating in a third country ):

6. Numărul de pașaport al plantei!Plant passport number: sau/or Numărul certificatului fitosanitar/ P hytosanitary certificate number:

7. P unctul de intrare declarat pentru mate rialul introdus dintr-o alta țară/ Dec lared point of entry for material introduced from a thi rd country:

8. Denumi rea(ile) științifică(e) a(le) materialului, inclusiv organismele dăunătoare respective/ Scientific name(s) of the materii, including

the harmful orgaanisms concerned:

9. Cantitatea de material/ Q uant i ty of mteria l:

10. Tipul de material/Type of material: 1 1. Declarația suplimentară/ Additional declaration:

Acest material este introdus I

pus în circulație în 1 Romania, conform legisla tie i în vigoare/ T his material is introduced into/ moved within 1 Romania, under the applicable law 12.

Informații suplimentare/ Additional information:

13. Avizarea materialului de către organismul oficial responsabil din l ocul de origine/ Endorsement by the responsible official body in the place of origin

Locul avizării/ Place of endorsement: Data/Date: Numele și semnătura funcționarului autorizat/ Name and signature of authorized officer:

14. Ștampila organismului oficial responsabil emitent/ Stamp ofthe responsible official bo dy ofissue: Lo cul

eliberării/ Place of issue:

Data/ Date:

Numele și semnătura funcționaru l u i autorizat/ Name and signature of au tho rized officer:

NB: Rubricile sau zonele colorate in gri nu se completeaza/The requirements in gray are not app l icable 1 Se taie unde nu este aplicabil/ Delete if not applicable

ANEXA

Nr. 3 RO.MANIA §Cfil§OARJE DE AUTOW:Z.ARE lLETTER OF AUTHOfilTY

1. Numele și adresa expeditorului/Organizaatiaa de protectia plaantelor din taaraa de origine Name and address of the consignor/ Plant protection organizaation ofthe country of origin: §cirliso!llirie idlie ă!ll11!11:oiri.7l!llire lP'ellll1tll"\lll i.llll11:ll"Olidllll!ceireai și!Sl!lllll JP>lllllllllell"le!ll ÎI!ll dirclll!Ilaiție ăl) oJrgainnns!lllllefoir idliiillll111.ătoaiirie, pilaillil11:elloJr, piroidll!llseBoiir nge11:aJJile s!llun !llll1ftcoiBefon- iregDennnel!ll11:ai11:e JP>iellll11:Im ie:1.1:JP>ieiriel!Il1te, sco[l)l!l!Iri. ștJiiinnțRfficie sH e:1.1:peiri.nnneml!lllle și. fPll!l!IIl11:Irl!llIllll!cirii\iri. JPll!l sel.ecți.i. vaiirfiet2Ile !Let11:eir o1FH1l:lbmiri.fy JFoiir 11:llne i.!lll1tll"Oidllllldiiol!Il lllllllidll<oiir Rllll«Jl"lel!llllllll!Il11: o1Fl!n!i!ll°llllll1Fl!l!Il oiirgaunismms, jp>Il!1ll!Il1ts, ]Plftai!lllt JP>ll°®idll!llds ai111.idl 011:llneir objeds foir 11:iriall oir sdellll1l:illnc ]Pll!llll'l!)>Oses !1ll!Il«ll foir woirlk OI!ll

v!llirid!llll selliediiol!lls

2. Numele și adresa persoanei competente pentru activitățile aprobate/ Name and address of the person responsible for the aapproved aactivities:

3. Numele organului oficial competent I Name of the responsible official body

4. Adresa și descrierea locului sau locurilor specifice pentru detinerea în carantină/ Address and description of the specific site or sites for quarantine containement:

5. Locul de origine (dovada documentară anexată pentru materialele originare dintr-o alta țară)/Place of origin (documentary evidence attached for material originating in a third country ):

6. Numărul de pașaport al plantei/Plant passport number:

sau/or Numărul certificatului fitosanitar/ Phytosanitary certificate number:

7. Punctul de. intrare declarat pentru materialul introdus dintr-o alta țară/ Declared point of entry for material introduced from a third country:

8. Denumirea(ile) științifică(e) a(le) materialului, inclusiv organismele dăunătoare respective/ Scientific name(s) of the materii, including the harmful orgaanisms concemed:

9. Cantitatea de material/ Quantity of mterial:

10. Tipul de material/Type of material:

11. Declarația suplimentară/ Additional declaaration:

Acest material este introdus/ pus în circulație în 1 Romania, conform legislatiei in vigoare/ This material is introduced into/ moved within I

Romania, under the applicable law

12. Informații suplimentare/ Additional information:

13. Avizarea materialului de către organismul oficial responsabil d i n tara de origine/ Endorsement by the responsible official body in the country of origin Locul av i zării/ Place of endorsement: Data/Date: Numele și semnătura funcționarului autorizat/ Name and signature of authorized officer:

14. Ștampila organismului oficial responsabil emitent/ Stamp ofthe responsible official body ofissue: Locul eliberării/ Place of issue: Data/Date: Numele și semnătura funcționarului autorizat/ Name and signature of authorized officer:

NB: Rubricile sau zonele colorate in gri nu se completeaza/The requirements in gray are not applicable 1

Se taie unde nu este aplicabil/ Delete if not applicable

MĂSURI DE CARANTINĂ,

INCLUSIV TESTAREA MATERIALULUI DESTINAT SCOATERII DIN CARANTINĂ

PARTEA A

Pentru anumite materiale enumerate în Anexa 3 a Hotărârii Guvernului nr. 1030/2001 privind măsurile de protecție împotriva introducerii și răspândirii organismelor de carantină dăunătoare plantelor sau produselor vegetale în România. Secțiunea 1: Plante de Citrus L, Fortunella Swingle, Poncirus Raf și hibrizii acestora, altele decât fructele și semințele

1. Materialul, după caz, se supune procedurilor adecvate de terapie prevăzute în Ghidul tehnic FAO/IPGRI.

2. Materialul, urmând procedurile de terapie n1entionate la punctul 1, este indexat. Întregul material, inclusiv plantele pentru indexare, se păstrează în instalațiile aprobate, în condițiile de izolare în carantină, mentionate în Anexa 1. ' Materialul destinat aprobării pentru scoaterea din carantina se păstrează în condiții care să permită un ciclu normal de vegetație și se supune inspecției vizuale, la sosire și ulterior, la momente potrivite, pe durata indexarii, in vederea identificarii semnelor și simptomelor produse de organisme dăunătoare, inclusiv de toate organismele dăunătoare relevante enumerate în Hotărârea - '

Guvernului numarul 1030/2001 privind măsurile de protecție împotriva introducerii și răspândirii organismelor de carantină dăunătoare plantelor sau produselor vegetale în România.

3. Confonn punctului 2, materialul identificat) pentru organisme următoarelor proceduri: este indexat (testat și dăunătoare,

respectand 3.1.

Testarea este efectuata prin metode adecvate de laborator și când este cazul; plante indicator, inclusiv Citrus sinensis (L.) Osbeck,

C. aurantifolia Christm. Swing,

C. medica L.,

C. reticulata Blanco și Sesamum L., pentru a detecta cel puțin următoarele organisme dăunătoare:

a) Citrus greening bacterium

b) Citrus variegated chlorosis

c) Citrus mosaic virus

d) Citrus tristeza virus (toate izolatele)

e) Citrus vein enation woody gall t) Leprosis

g) Naturally spreading psorosis

h) Phoma tracheiphila (Petri) Kanchaveli & Gikashvili

i) Satsuma dwarf virus

j) Spiroplasma citri Saglio et al

k) Tatter leaf virus

i) Witches broom (MLO)

m) Xanthomonas campestris (toate tulpinile patogene la Citrus) 3.2.

Pentru boli precum "Blight and blight Iike", pentru care nu se poate face indexarea rapida, materialul trebuie supus, la sosire, testării prin grefarea mugurelui terminal pe un portaltoi crescut în cultură sterilă, conform cu Ghidul tehnic al FAO/IPGRI, iar plantele rezultate se supun procedurilor de terapie prevăzute la pct. 1.

4. Materialul supus inspecțiioIr vizuale la care se referă punctul 2 și la care s-au observat semnele și simptomele produse de organismele dăunătoare este supus unei investigații incluzând testarea, când ste cazut pentru identificarea cât mai rapidă a organismelor _ dăunătoare care au cauzat semnele și simptomele respective.

Secțiunea 2: – Plantele de Cydonia Mill, Malus Mill, Prunus L.

și

Pyrus L. și hibrizii acestora și Fragaria L., destinate plantării, altele decât semințele

1. Materialul se supune, dupa caz, procedurilor adecvate de terapie prevăzute în Ghidul tehnic al FAO/IPGRI.

2. Materialul, urmând procedurile de terapie prevăzute la punctul I, se supune procedurilor de indexare în totalitatea sa. Întregul material, inclusiv plantele pentru indexare, se păstrează în instalații, în condițiile de carantină mentionate la Anexa 1. Materialul care trebuie aprobat pentru scoaterea din carantina se. păstrează în condiții favorabile aparitiei semnelor și simptomelor de organisme dăunătoare, inclusiv toate organismele dăunătoare relevante listate în Hotărârea Guvernului numarul 1030/2001 privind măsurile de protecție împotriva introducerii și răspândirii organismelor de carantină dăunătoare plantelor sau produselor vegetale în România, la sosire și ulterior, la momentele potrivite, în timpul procedurilor de indexare. 3.1. Conform punctului 2, materialul se indexează pentru depistarea organismelor dăunătoare (testare

și identificare), după următoarele proceduri: 3.2.

Pentru

Fragraria L.,

indiferent de țara de ong1ne a materialului, pentru testare se folosesc metode adecvate de laborator și, când este cazul, plante indicator,

inclusiv Fragraria vesca, F virginiana și Chenopodium spp. pentru a detecta cel puțin următoarele organisme dăunătoare:

a) Arabis mosaic virus

b) Raspberry ringspot virus

c) Strawberry crinkle virus

d) Strawberry latent "C" virus

e) Strawberry latent ringspot virus

f) Strawberry mild yellow edge virus

g) Strawberry vein banding virus

h) Strawberry witches' broom MLO

i) Tomato black ring virus

j) Tomato ringspot virus

k) Colletotrichum acutatum Simmonds

I)

Phytophthora fragariae Hickman var. fragariae Wilcox & Duncan (m)Xanthomonas fragariae Kennedy & King 3.2.1.

În cazul Malus Mill: când materialul provine.dintr-o țară care nu este cunoscuta a fi libera de unul din următoarele organisme dăunătoare:

a) Apple proliferation mycoplasm; sau

b) Cherry rasp leaf virus (American),

pentru testare se folosesc metode adecvate de laborator și, când este cazul, plante indicator pentru detectarea organismelor dăunătoare relevante și, 3.2.2. Indiferent de țara de origine a materialului, pentru testare se folosec metode adecvate de laborator și, când este cazul, plante indicator pentru detectarea a cel puțin următoarelor organisme dăunătoare:

a) Tobacco ringspot virus

b) Ton1ato ringspot virus

c) Erwinia amylovora (Burr.) Winsl. Et al. 3.3. Pentru Prunus L., după caz, pentru fiecare specie de Prunus:

(1) Când materialul este originar dintr-o țară care nu este cunoscuta a fi libera de oricare din următoarele organisme dăunătoare:

a) Apricot chlorotic leafroll mycoplasm;

b) Cherry rasp leafvirus (American); sau

c) Pseudomonas syringae pv. persicae (Prunier et al.) Young

etal, pentru testare se folosesc metode adecvate de laborator și, când este cazul, plante indicator pentru detectarea organismelor dăunătoare relevante și

(2) Indiferent de țara de origine a materialului,pentru testare se folosec metode adecvate de laborator și, când e te cazul, plante indicator pentru a detecta cel puțin următoarele organisme dăunătoare:

a) Little cherry pathogen (izolate non-Europene)

b) Peach mosaic virus (American)

c) Peach phony rickettsia

d) Peach rosette mosaic virus

e) Peach rosette mycoplasm

f) Peach X disease mycoplasm

g) Peach yellows mycoplasm

h) Plum line pattern virus (American)

i) Plum pox virus

j) Tomato ringspot virus

k) Xanthomonas camperesis pv. pruni (Smith) Dye. 3.4.

În cazul Cydonia Mill și · Pyrus L., · indiferent de țara de origine a 1naterialului,pentru

testare se folosesc metode adecvaJe de laborator, și, când este cazul, plante indicator, pentru a detecta cel puțin următoarele organisme dăunătoare:

a) Erwinia an1ylovora (Burr.) Winsl. Et al.

b) Pear decline mycoplasm

4. Materialul supus inspecțiilor vizuale mentionate la punctul 2 și la care s-au observat semne și simptome produse de organismele dăunătoare, se supune unei investigații, incluzând testarea când este cazul, pentru identificarea organismelor dăunătoare ce au cauzat semnele și simptomele respective. Sect. iunea 3: Plantele de Vitis L., altele decât fructele 1. Materialul se supune, după caz, procedurii adecvate de terapie, prevăzute în Ghidul tehnic al FAO/IPGRI. 2 (1) Materialul, urmând procedurile de terapie mentionate la punctul I, se supune procedurilor de indexare in totalitatea sa.

(2) Întregul material, inclusiv plantele pentru indexare, se păstrează în instalațiile aprobate, în condițiile de carantină specificate în Anexa 1.

(3) Materialul destinat aprobării pentru scoaterea din carantina se păstrează în condiții care să permită un ciclu vegetativ normal și va fi supus inspecției vizuale efectuate la sosire și ulterior, la momente potrivite, în timpul perioadei procedurilor de indexare, pentru detectarea semnelor și simptomelor produse de organismele

dăunătoare,

inclusiv

cele

cauzate

de Daktulosphaira vitifoliae (Fitch) și ale tuturor celorlalte organisme dăunătoare relevante listate în Hotărârea Guvernului numarul 1030/2001 privind măsurile de protecție împotriva introducerii și răspândirii organismelor de carantină dăunătoare plantelor sau produselor vegetale în România. Conform punctului 2, materialul se indexeaza pentru testarea și depistarea organismelor dăunătoare (testat și identificat) în conformitate cu următoarele proceduri:

3. Pentru materialul care provine dintr-o țară care nu este cunoscută ca fiind liberă de următoarele organisme dăunătoare:

a) Boala Ajinas ika.Pentru testare se foloseste o metodă adecvată de laborator iar, în cazul unui rezultat negativ, materialul vegetal va fi altoit pe soiul Koshu și ținut sub observație cel puțin două cicluri de vegetație.

b) Grapevine stunt virus. Pentru testare se folosesc plante indicator adecvate, inclusiv soiul

Campbell Early; jar observațiile se fac timp de un an.

c) Summer mottle. Pentru testare se folosesc plante indicator adecvate, inclusiv soiurile Sideritis, Cabernet-Franc și Mission.

Indiferent de țara de origine a materialului, pentru testare se folosesc metode adecvate de laborator și, când este cazul, plante indicator pentru

detectarea cel puțin următoarele organisme dăunătoare: (a) Blueberry leaf mottle virus (b) Grapevine flavescence doree MLO si altele (Grapevine yellows) (c) Peach rosette mosaic virus (d) Tobacco ringspot virus (e) Tomato ringspot virus (sușa "yellow vein"și alte sușe) (f) Xylellafastidiosa (Well & Raju) (g)

Xylophilus ampelinus (Panagopoulos) Willems et al.

4. Materialul supus inspecției vizuale prevăzuta la punctul 2 și pe care au fost observate semne și simptome de organisme dăunătoare se supune unei investigații care să includă testarea, unde este necesar, pentru a determina cât mai rapid posibil identitatea organismelor dăunătoare care cauzează semnele și simptomele. Sectiunea 4: Plante ale speciei Solanum L. care formeaza stoloni sau tuberculi sau hibrizii lor, destinate plantarii

1. Materialul, dupa caz, se supune procedurilor de tratament prevăzute in Ghidul Tehnic FAO/IPGRI. 2(1) Se indexeaza fiecare unitate a materialului, urmând procedurile de tratament prevăzute la punctul 1.

(2) Întregul material, inclusiv plantele pentru indexare, se pastreaza in instalatiile aprobate, t în condițiile de carantină prevăzute in Anexa 1.

(3) Materialul destinat scoaterii din carantina se pastreaza in conditii care sa permita un ciclu normal de crestere vegetativa si se inspecteaza vizual pentru semne si simptome produse de organismele daunatoare, inclusiv de toate organismele daunatoare relevante listate in Hotărârea Guvernului numarul l 030/2001 privind măsurile de protecție împotriva introducerii și răspândirii organisn1elor de carantină dăunătoare plantelor sau produselor vegetale în România si Potato yellow vein disease, la sosire si ulterior, la intervale regulate, până la sfarsitul ciclului vegetativ, pe toata perioada procedurilor de indexare. 3 Procedurile de indexare mentionate la punctul 2 urmeaza prevederile tehnice de la punctul 5, pentru a detecta cel putin urmatoarele organisme dăunătoare:

A- Bacterii

a) Clavibacter michiganensis (Smith)

Davis et al ssp. Sepedonicus (Spieckermann et Kotthoft) Davis et al;

b) Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith, cunoscuta si sub numele de Ralstonia solanacearum (Smith) Smith

c) Testarea tuberculilor nou formați, sau a bazei tulpinii, pentru speciile care nu formează tuberculi, este recomandată pentru un ciclu normal de creștere vegetativă care urmează testării menționate la punctul a si b.

d) Pentru materialul menționat la punctul a, in vederea testarii metoda de testare pentru Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. ssp. sepedonicus (Spieckermann et Kotthoff) David et al. se foloseste metoda descrisa in sectiunea 5 a prezentei Anexe. Pentru materialul menționat la punctul b, poate fi aplicată aceasi metodă de testare.

e) Pentru materialul mentionat la punctul a, în vederea testârii pentru Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith, Ralstonia solanacearum (Smith) Smith, se aplica metodele aprobate prin Ordin al Ministrului " Agriculturi, Alitnentatiei si Padurilor. 8- Virusuri si organisme analoage virusurilor, altele decat Potato spindle tuber viroid.

a) Testarea minimă pentru tuberculi, plante tinere si butași, incluzând micro-plante, include un test serologic făcut la sau aproape de înflorire pentru fiecare din organismele dăunatoare listate, altele decât Potato spindle tuber viroid, urmat de un test biologic al materialului gasit negativ la testul serologic.

b) Pentru Potato leaf roll virus, se fac două teste serologice.

c) Testarea miriimă pentru să1nânța de cartof consta intr-un test s_erologic.sau

bi logic, dacă nu este disponibil unul serologic. Pentru •

probele gasite negative se recomanda retestarea unei parți din probe; pentru rezultatele incerte, se face testarea materialului prin alta metoda.

d) Testările serologice și biologice menționate la punctul 5 B(a)(b) (cj vor fi făcute pe plante crescute în sera pe probe luate din cel puțin două poziții de pe fiecare tulpina, incluzând o frunză tânără întreagă din vârful fiecarei tulpini și o frunză mai veche de la mijlocul tulpinii. Trebuie ridicate probe din fiecare tulpina datorită posibilei existențe a unei infecții nesistemice. În cazul testelor serologice, proba de analizat trebuie să fie formata din frunze prelevate de pe aceeași plantă. Nu se recomandă amestecarea frunzelor prelevate de la mai multe plante decât dacă proportia de amestec a fost validată printr-o metodă specială. În cazul testărilor biologice, proba este formata din frunze prelevate de la maxim cinci plante cu inocularea a cel puțin doua plante din fiecare specie indicator.

e) Plantele indicator adecvate pentru folosire în testarea biologică menționată la punctul 5 B(a),(c ) sunt cele listate de catre Organizația Europeană și Mediteraneană pentru Protecția Plantelor (OEPP), sau alte plante indicator aprobate oficial, despre care s-a dovedit ca detectează virusurile respective.

f) Se scoate din carantină numai materialul care a fost direct testat.

După efectuarea testarii ochiurilor, se scoate din carantină numai materialul (plantulele) rezultat din tuberculii analizați. Nu este permisă scoaterea din carantînă a tuberculului ca atare

din cauza posibilelor

probleme cu

infecțiile nonsistemice. C - Potato spindle tuber viroid

a(1) Pentru întregul material, se testeaza plante cultivate în ser'½ de îndată ce s-au acomodat bine, dar înainte de înflorire și producerea polenului.

(2) Testarea lăstarilor tuberculilor,a plantulelor crescute in vitro sau a răsadurilor tinere este privită numai ca o testare preliminară.

b. Probele se alcătuiesc dintr-o frunză complet dezvoltată din vârful fiecarei tulpini a plantei.

c. Întregul material pentru testare se cultiva la temperaturi care să nu fie mai mici de 18 ° C (preferabil la temperaturi mai mari de 20 ° C) și la o fotoperioadă de cel puțin 16 ore.

d. Testarea probelor de ADN și ARN se radioactivă sau neradioactivă, retum-PAGE Ag)sau prin RT-PCR. face pnn marcare (prin colorare cu

e. Proportia maxima de amestecare pentru alcătuirea unei probe și return-PAGE este de cinci plante, iar utilizarea acesteia sau a proportiilor mai mari trebuie validată. 1 Sectiunea 5: Metoda pentru detectarea si diagnosticarea bacteriei care provoaca putregaiul inelar al cartofului, Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. ssp. Sepedonicus (Spieckermann et Kotthof) Davis et al. in loturile de tuberculi de cartofi

1. Prelevarea conurilor.

L 1 Se spala 200 de tuberculi in apa de la robinet si de indeparteaza epiderma dinjurul punctului de insertie al fiecarui tubercul de cartof, folosirid un bisturiu sau un cutit de curatat cartofi, desinfectat periodic c;lezinfectia de poate face prin înmuierea cutitului in solutie de ethanol 70% inainte de flambare. 1.2. a) Se scot cu grija conu i de tesut din punctul de insertie al cartofului cu un bisturiu sau un cutit de cartofi, evitandu-se prelevarea de tesut nevascular in exces.

b) Dupa scoatere, conurile trebuie-- •, prelucrate in maxim 24 de ore (v. paragraful 3) sau pastrate timp de maxim doua saptamani, la o temperatura de -20 ° C.

2. Examinarea vizuala a simptomelor vestejirii bacteriene.

Dupa scoaterea conurilor, se sectioneaza fiecare tubercul si sț cauta prezenta simptomelor de putregai inelar.

Se storc tuberculi si sa urmareste daca din tesutul vascular exudeaza tesuturi macerate.

Simptomele timpurii se prezinta sub forma unui aspect usor sticlos sau translucid a tesutului, fara inmuiere in jurul tesutului vascular aceste simptome in specia. I in punctul de insertie al tuberculului.

Inelul vascular poate prezenta, la punctul de insertie, o culoare usor mai închisa decat cea normala. - Primele simptome - usor identificabile apar sub forma unei coloratii galbui inelului vascular. Cand tuberculul este presat usor, din vase se elimina un exudat cu un aspect branzos. Acest exudat contine milioane de bacterii si, in aceasta faza, se poate produce o colorare bruna a tesutului vascular. La inceput, aceste simptome pot aparea doar pe o parte a inelului, nu neaparat in apropierea punctului de insertie, si apoi se extind treptat pe tot inelul. Pe masura ce infectia avanseaza, tesuturile vasculare sunt distruse si cortexul extern se poate separa de cel intern. In stadiile avansate ale infectei,

apar crapaturi la suprafata tuberculului, avand adesea o culoare brun-rosietica pe margini. Simtomele pot fi mascate de invazii fungice sau bacteriane secundare si este foarte dificil, daca nu imposibil, sa se. distinga simptomele avansate ale putregaiului inelar de celelalte putregaiuri ale tuberculului.

3. Pregatirea probelor pentru coloratia Gram, colorarea pnn imunoflorescenta (IF) si testul pe vinete 3.1 Se omogeneizeaza conurile pana la macerare completa intr-un diluant cunoscut ca fiind netoxic pentru Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus (de exemplu tampon fosfat salin 0.05 M (TFS) de 0.05 M si pH 7.0), la o temperatura mai mica de 30 de garde C. Se recomanda adaugarea unui defloculant netoxic și a unui agent antispumant netoxic (apendice 1 și 2). Trebuie evitata o macerare excesiva. 3.2 Se extrag bacteriile din amestecul omo_gen prin una din 1netodele urmatoare 1:

A. a) Se centrifugheaza la nu mai mult de 180 g timp de 10 minute;

b) Se centrifugheaza supematantul la nu mai puțin de 4 OOO g timp de 1 O minute. Se lasa la decantat, iar apoi supematantul se elimina. 1 O metoda de extractie alternativa este data de Dinesen, 1984 1

Exista

dovada (Jansr

si

Van

Varrenberg, 1987)

că

prin

congelare

se

poate

reduce

viabilitatea

lui

C.m.

spp.

Sepedonicus.

Se

recomandă

suspensia

depozitului

in

solutie

de

glicerol 10%. 4.3 Se identifica probele care conțin celule corineforme tipice, Gram pozitive. În general, celulele de C.m. spp.sepedonicus au o lungime de 0,8 până la 1,2 µm și o lățime de 0,4 până la 0,60 µm.

În apendicele 3 se indică un procedeu de colorare adecvat.

Preparatele din infecții naturale sau culturi recent izolate prezintă adesea o predominanță de bastonase cocoide, care sunt de obicei mai mici decât celulele din culturile mai vechi insamantate pe mediu de agar. I " n majoritatea mediilor de cultură, celulele de C. m. spp.sepedonicus se prezinta ca niste bastonase corineforme pleomorfe și pot da o reacție Gram variabilă. Celulele sunt unice? în perechi cu „coturi" caracteristice, tipice pentru divizarea corinebacteriilor și, ocazional, în grupuri neregulate asemenea unor palisade și litere chinezești.

5. Protocol pentru testarea IF 5.1 Se utilizează un antiser pentru o tulpina cunoscută de C. m. spp.sepedonicus-ATCC 33113 (NCPPB 2137) sau NCPPB 2140. Aceasta trebuie să aibă un titru IF mai mare de 1:600. Se include un control TFS pe lama de testare pentru a se determina dacă imunoglobulina anti-iepure conjugată cu izotiocianat de fluoresceina (ITCF) se combină nespecific cu celulele bacteriene. C.m. spp.sepedonicus (ATCC 33113 (NCPPB 2137 ), NCPPB 2140) ar trebui utilizat ca si control de antigen omolog pe o lama separata. Țesutul infectat natural (conservat prin liofilizare sau congelare la-20 C) se utilizează, dacă este posibil, ca un control similar pe aceeași lamelă (figura 2). 5.2 Procedeul 5.2.1 Din depozitul-final, se prepara trei serii de dilutii (10\ 10 2, 10 3 ) in apa distilata (figura 1). 5.2.2. Din fiecare diluție a depozitului sau din fiecare suspensie de

C.m. spp, sepedonicus (aproximativ 10 6 celule/ml), se pipeteaza un volum standard masurat, suficient pentru a acoperi godeul (aproximativ 25µ1), în godeurile unei lame cu spoturi multiple

după cum se prezintă în figura 1. 5.2.3. Se lasa la uscat la o temperatura de aproximativ 37 °C s1 se fixeaza cu solutie de etanol 95% sau prin flambare. Figura I

Lamela de control cu mostra si tampon fosfat salin Mostră nediluată

Mostră diluată 1:10 1:100 1:1000 ( \,, _/,.:, "\ 1 -,,,, r -- l

f,,/

J ) ' I în dupHcat 00000,,

Antiser la soluția selectată

Figura 2 Lama de control pozitiv 00000 00000

- C. sepedonicus

C 1C)61ml

- Extract pozitiv de cartofi

t '

t

f

t

1:200 1:400 1:800 1:1800 1:3200.

Concentrația de antiscrum

5.2.4 Se acopera godeurile respective cu antiser pentru C. m. spp. sepedonicus la dilutiile recomandate, TFS de O.O1, pH 7.2, conform figurii 1. (Se utilizeaza TFS pentru controlul ITCF). Dilutia de lucru a antiserului trebuie să fie egala cu aproximativ jumătate din titrul IF. Dacă trebuie folosite alte diluții antiser, se pregătesc lame separate pentru fiecare diluție ce urmează a fi utilizată.

5.2.5. Se incubează într-o cameră umedă, la temperatura ambiantă, timp de 30 de minute. 5.2.6. Se clătește cu grijă cu TFS de 0,01 M și pH 7,2. Se spală timp de 5 minute în trei reprize cu TFS 0,01 M și pH 7,2, schimbandu­ se de fiecare data solutia de spalare. 5.2.7. Se elimină cu grijă excesul de umezeală.

5.2.8. Se acoperă fiecare godeu cu conjugat ITCF în aceeași diluție utilizată pentru determinarea titrului și se incubează-într-o cameră umedă întunțcoasă, la temperatura ambiantă, timp de 30 de minute.

5.2.9. Se clătește și se spală ca mai înainte. 5.2.10. In fiecare godeu, se pun 5 până la 10 µl de glicerina tamponată cu fosfat 0.1 M, cu pH 7,6 (sau o valoare similară cu un pH de minimum 7,6) și se acoperă cu o lamela (apendice 2).

5.2.11 Se examinează cu un microscop prevăzut cu o sursă de lumină epifluorescentă și filtre adecvate pentru ITCF. Se recomanda folosirea unui obiectiv cu o putere de marire de 400x până la 1 OOOx. Se scanează fiecare godeu replicat de-a lungul a două diametre perpendiculare și de-a lungul perimetrului acestuia.

Se observă celulele fluorescente din controalele pozitive și se determină titrul acestora. Se observă celulele fluorescente din gqdeul de control ITCF/TFS și, dacă acestea sunt absente, atunci se continuă cu godeurile de test. Se determină, în minimum 1O câmpuri microscopice, numărul mediu de celule fluorescente tipice morfologic per camp și se calculează populatia de celule pe mililitru de depozit nediluat (apendice 4).

In timpul testului de imunofluorescență, pot aparea mai multe probleme.

Populatii de bacterii saprofite pot indica celule fluorescente atipice morfologic si pot provoca reactii incrucisate. Alte bacterii pot parea asemanatoare cu C.m ssp. sepedonicus ca talie si morfologie. Se iau in considerare daor celulele fluorescente cu talie si morfologie tipice.

Din cauza posibilității producerii unor reacții încrucișate) probele cu un test de imunofluorescență pozitiv trebuie să fie retestate utilizând un antiser diferit.

Limita tehnică de detectie a acestei metode se situează între 10 3 și 10 4 celule pe ml de depozit nediluat. Probele cu un număr de celule tipice fluorescente la limita detecției sunt de obicei libere de C.m. ssp. seped01yicu,

dar pot fi supuse testului vinetei.

Testul IF este negativ pentru toate probele in care nu s-a gasit nici o celula fluorescenta cu morfologie tipica. Se considera ca aceste probe sunt „necontaminate" cu C. m. ssp. sepedonicus.

Testul vinetei nu este necesar.

Testul IF este pozitiv pentru toate probele in care s-au identificat celule florescente cu morfologie tipica.

Probele la care s-a identificat un test de imunofluorescență pozitiv cu ambele antiseruri sunt considerate ca „potențial contaminate" cu C. m. ssp. sepedonicus.

Testul vinetei este necesar pentru toate probele considerate a fi potențial contaminate.

6. Testul vinetei

Pentru detalii de cultură, vezi apendicele 5. 6.1 Depozitul obtinut la punctul 3.3 se inoculeaza la cel puțin 25 de vinete aflate stadiu de trei frµnze (apendice 5) printr-una din metodele indicate mai jos (punctele 6.2, 6.3 sau 6.4). 6.2. Inoculare prin tăiere I 6.2.1. Se aseaza fiecare ghiveci in pozitie orizontală intr-o excavatie facuta pe o placa de polistiren expandat cu dimensiunile de 5 cm x 1O cm x 15 cm (HxlxL) (figura 3); excavatia de mai sus este adecvata pentru un ghiveci de 1O cm. Intre tulpina vinetei si placa de polistiren expandat se introduce o folie de aluminiu sterilă pentn1 fiecare mostra testata. Planta este fixată în jurul placii cu o bandă de cauciuc. 6.2.2. Cu ajutorul unui bisturiu, se execută îQtre cotiledoane și prima frunză o tăietură longitudinală sau ușor diagonală de 0,5 până la 1 cm lungime și cu o adâncime de aproximativ trei pătrimi din diametrul tulpinii. 6.2.3. Se t, ine deschisă tăietura cu vârful lamei bisturiului si cu ajutorul unei pe)lsule fine, înmuiata in inocul, se tamponeaza peretii taieturii. Toate vinetele se inoculeaza in mod asemanator.

Figura 3 6.2.4 Se închide tăietura cu vaselină sterilă, folosind o seringă de 2 ml. 6.3. Inoculare prin tăiere li 6.3.1 Se ține planta între două degete și se pipeteaza o picatura (circa 5 până la 1O µl) din inocul pe tulpină, între cotiledoane și prima frunză. 6.3.2. Utilizând un bisturiu steril, se execută o tăietură in diagonală (într-un unghi de aproximativ 5°), cu o lungime de 1,0 cm și o adâncime de aproximativ 2/3 din grosimea tulpinii, tăietura începând de la picătura de inocul. 6.3.3. Se închide tăietura cu vaselină steFilă cu ajutorul unei senng1. 6.4 Inoculare prin seringa 6.4.1. Vinetele nu se udă cu o zi înaintea inoculării pentru a reduce turgescenta 6.4.2. Se inoculează tulpinile de vânătă exact deasupra cotiledoanelor folosind o seringă cu ac hipodermic (de minimum 23G). Se distribuie inoculul intre toate plantele. 6.5 Se inoculează 25 de vinete cu o cultură cunoscută de C.m. ssp. sepedonicus și, dacă este posibil, cu un țesut de tubercul infectat (punctul 5.1.) prin aceeași metodă de inoculare (punctele 6.2., 6.3. sau 6.4.). 6.6 Se inoculează 25 de vinete cu TFS steril de 0,05 M prin aceeași metodă de inoculare (punctele 6.2., 6.3. sau 6.4.). 6.7. Vinetele se incubează în condiții corespunzatoare (apendice 5) timp de 40 de zile. Se examinează regulat simptomele după opt zile. Se numără vinetele care prezintă simptome. C.m.

ssp.

sepedonicus cauzează ofilirea frunzelor vinetelor, care poate începe ca o înmuiere marginală sau intemervuriana. Țesutul ofilit poate să aibă inițial o culoare verde închis sau pestriță dar care devine mai pală înainte de necrozare. Ofilirile intemervuriene au adesea un aspect unsuros apos. Țesutul necrozat are adeseori o margine galbenă strălucitoare. Vinetele nu mor neapărat cu cât este mai îndelungată perioada care precede apariția simptomelor cu atât cresc șansele de supraviețuire. Vinetele pot învinge infecția. Vinetele tinere susceptibile sunt mult mai sensibile la populațiile reduse de C. m. ssp. sepedonicus decât plantele mai bătrâne, de unde necesitatea de a utiliza vinete aflate în stadiu de trei frunze sau exact înaintea acestuia.

Ofilirile pot fi provocate de asemenea de populații de alte bacterii sau ciuperci prezente în depozitul tesutului de tubercul. Acestea includ Envinia carotovora, ssp. carotovora și E. Carotovora ssp. atrosepiica, - Plioma exigua var. foveata precum și de populații mari de bacterii saprofite. Aceste ofiliri pot fi deosebite de cele cauzate de C. m. ssp. sepedonicus deoarece toate frunzele sau întreaga vânătă se ofilesc rapid. 6.8 Se prepară o colorație Gram (punctul 4) pentru toate loturile de vinete care prezintă simptome, utilizând secțiuni de țesut de frunză ofilită și de tulpină de vânătă și se izolează într-un mediu nutritiv adecvat (punctul 7). Se dezinfectează frunzele și tulpinile vinetelor prin ștergere cu o soluție de etanol 70 %. 6.9 În anumite cazuri, în special dacă condițiile de creștere nu sunt optime, este posibil ca C. m. ssp. sepedonicus să existe ca o infecție latentă în vinete chiar după incubația de 40 de zile. Aceste infecții pot avea ca rezultat piticirea și pierderea vigorii vinetelor inoculate. Dacă testul IF este considerat pozitiv, se poate considera că este necesară o testare suplimentară. -Este esențial sa se compare ratele de creștere ale tuturor plantelor supuse testului vinetei cu controalele inoculate cu TFS steril de 0,05 M și să se 1nonitorizeze conditiile de mediu din sera. ' Recomandările pentru testele ulterioare sunt următoarele: 6.9.1. Se taie tulpinile deasupra locului inoculării și se îndepărtează frunzele. 6.9.2. Se macerează tulpinile în TFS de 0,05 M și pH 7,0 ca la punctele 3.1 până la 3.2. 6.9.3. Se utilizează o jumătate de suspensie pentru a efectua o colorație Gram (punctul 4) și un test IF (punctul 5). 6.9.4. Se utilizează cealaltă jumătate pentru un nou test al vinetei (punctlll 6), dacă colorația Gram și/sau testele IF sunt pozitive. Se folosește o cultură cunoscută C. m. ssp. sepedonicus și controale sterile_de TFS 0,05 M. Dacă nl! se observă simptome în testul ulterior, proba este considerată negativă.

7. Izolarea lui Cm. ssp. sepedonicus

Diagnosticul poate fi confinnat doar dacă C. m. ssp. sepedonicus

este i olat și identificat ca atare (punctul 8). Deși C m. ssp. Sepedonicus este un organism dificil, el poate fi izolat din țesutul care prezinta simptome. Totuși el poate fi mascat prin cresterea rapidă de bacterii saprofite și de aceea, izolarea directă din depozitul de țesut de tubercul (punctul 3.3.) nu este recomandată. Vinetele asigură un excelent mediu selectiv de îmbogățire pentru dezvoltarea lui C.

m. ssp. sepedonicus si, de asemenea, un excelent test gazdă de confirmare. Se fac izolări din toți tuberculii de cartof și vinete care prezinta simptome (punctele 4, 6). Dacă este necesar, macerarea tulpinilor vinetelor se face ca la punctele 3. și 6.9. 7.1 Suspensiile se insamanteaza in striuri pe unul din urmatoare_le medii (formulele sunt indicate in apendicele 6): ·

nutritiv dextroză-agar (numai pentru subculturi), drojdie-peptona-glucoză-agar,

drojdie-dextroză-agar,

drojdie de extract de săruri minerale agar. Se incubează la 21° C timp de 20 de zile.

C. m. ssp. sepedonicus crește încet, producând de obicei colonii cu un vârf ascuțit, cremos, de forma unei cupole, în termen de 1O zile.

Pentru stabilirea puritatii, suspensia se re-insamanteaza in striuri

Ratele de creștere sunt îmbunătățite prin subculturi. Coloniile tipice sunt de un alb cremos sau ivoriu, rotunde, netede, înălțate, cu formă de cupola convexa, muc. oid fluide, cu margini întregi și cu un diametru de 1 până la 3 mm.

g. Identificarea

Din plantele sanatoase sau bolnave de cartofi și vinete se pot izola numeroase bacterii corineforme Gram pozitive, cu caractere coloniale similare celor produse de C. m. ssp. sepedonicus. În acest context, C. m. ssp. sepedonicus poate fi identificat prin următoarele teste:

Testul IF (punctul 5.1), testul vinetei,

testele de nutriție și fiziologice (apendice 7),

- testul oxidării/fermentării (0/F), - testul oxidazei, - creșterea la 37° C, - producția de urează, - hidroliza esculinei, - hidroliza amidonului, - toleranța la o soluție de clorură de sodiu 7 %, - testul indolului, - testul catalazei, - producția de H 2 S, - utilizarea citratulu( - hidroliza gelatinei, - acid din: glicerol, lactoză, ramnoză și salicina, - coloratia Gram.

Toate testele trebuie să includă un control cunoscut de C.m. ssp. sepedonicus. Testele nutriționale și fiziologice se fac utilizând inoculuri din subculturile agar. Comparațiile morfologice se fac din culturi de dextroză agar.

Pentru testul IF, populațiile de celule trebuie să fie ajustate la 10 6 celule/ml. Titrul IF trebuie să fie similar celui al culturii cunoscute de C. m. ssp. sepedonicus.

Pentru testul vinetei, populațiile de celule trebuie să fie ajustate la 10 7 celule/ml. Testele vinetei se fac utilizând zece plante pentru fiecare din organismele testate, utilizand din nou cultura cunoscuta je C. m. ssp. sepedonicus și controale de apă sterilă; în cazul culturilor pure ofilirea se obține în 20 de zile, dar plantele care nu prezintă simptome după această perioadă trebuie să fie incubate pe o durată totală de 30 de zile, la temperaturi care să determine dezvoltarea vinetelor,dar fără să depășească 30°C (apendicele 5).

Dacă după 30 de zile simptomele nu sunt prezente, nu se poate confirma prezenta lui C. m. ssp. sepedonicus in cultura respectiva.

Testul 0/F

Oxidază Catalază

Reducția nitraților Activitatea ureazei Producția de H2S Producția de indol Utilizarea citrat, ilor

C.m. ssp. Sepedonicus

Inert sau slab oxidativ

Hidroliza amidonului - sau slab Creșterea la 37 °

Creștere.'! în soluție de NaCI 7 - % -

Hidroliza gelatinei

Hidroliza esculinei

Acid din:

- glicerol - lactoză - sau slab -ramnoză - salicina

Apendicele 1

FORMULA FLUIDULUI DE MACERARE RECOMANDAT DE LELLIOTT ȘI SELLAR, 1976

Compus D C silicon MS A (Hopkins Williams 1O ml Ltd, Cat.

Nr. 9964 - 25, Chadwell Heatch,

Essex, Anglia)

Fulgi de lubrol W (ICI Ltd) 0,5 g

Pirofosfat de tetrasodiu 1 g

Tampon fosfat salin 0,05 M cu pH 7,0 1 litru (apendicele 2)

SOLUT • II TAMPON

Apendicele 2

Tampon fosfat salin 0,05 M cu pH 7,0

Această soluție tampon poate fi folosită pentru macerarea țesuturilor de tuberculi (2.1)

Na2HPO4 KH2PO4

NaCl

Apă distilată până la

Tampon fosfat salin de 0,01 M cu pH 7,2

Această soluție tampon este utilizată pentru diluarea antiserurilor și spălarea lamelelor IF

Na 2 HPO412 H2O -- NaH2PO42 H2O

NaCl

Apă distilată până la

Glicerină fosfatică tamponată de 0,1 M cu pH 7,6

Această soluție tampon este utilizată pentru mărirea fluorescentei în cadrul testului IF

2

' Na HPO412 H2O

NaH2PO42 H2O

Glicerol Apă distilată

4,26 g

2,72 g

8,0 g

1 litru

2,7 g

0,4g

8,0 g

1 litru

3,2 g

0,15 g

50ml 100

ml

Apendicele 3

PROCEDEUL COLORĂRII GRAM (MODIFICAREA LUI HUCKER) (DOETSCH, 1981)

Solut • ie de cristale violete

Se dizolvă 2 g de violet cristalin în 20 ml etanol 95 %. Se dizolvă 0,8 g oxalat de amoniu în 80 ml apă distilată. Se amestecă solut, iile.

Iodul Lugol

Iod 1 g

Iodură de potasiu 2 g Apă distilată 300 ml

Cristalele solide sunt pisate într-un mojar. Se adaugă apă și se agită până la dizolvare într-un recipient închis.

Solutia de colorare cu safranina

'

>,

Se alcătuieste solutia:

Safranina O Etanol 95 %

2,5 g

100ml

Se amestecă și se stocheaza.

Se diluează: 1:1O pentru a obține o soluție de lucru.

Procedeul de colorare

1. Se pregătesc frotiurile și dispozitivele de uscare și încălzire cu aer.

2. Se imersează lamela într-o soluție de violet cristalin timp de un minut.

3. Se spală cu apă de Ia robinet.

4. Se imersează în iod Lugol timp de. un minut.

5. Se spală cu apă de la robinet și se uscă cu un absorbant..

6. Se decolorează cu etanol 95 %, adăugat prin picurare,. până când nu se mai decoloreaza sau se imersează in etanol timp de 30 de secunde, agitand usor.

7. Se spală cu apă de la robinet și se usucă cu un absorbant.

8. Se imersează în soluție de safranina timp de 10 secunde.

9. Se spală cu apă de la robinet și se usucă cu un absorbant.

Colorația bacteriilor Gram pozitive este violet-albastră; bacteriile Gram negative au o colorație roz-roșie.

Apendicele 4

DETERMINAREA POPULAT,

IEI DE CELULE POZITNE LA TESTULIF

Aria (S) godeului lamelei multispot

- 4

(1) Unde D = diametrul ferestrei. Aria(s) câmpului obiectivului

JZd2

= 4

(2) unde d = diametrul campului.

Se calculează d prin măsurare directă sau prin formulele următoare:

unde i = coeficientul câmpului (depinde de tipul ocularului și variază de la 8 la 24)

K = coeficientul tubului (1 sau 1,25)

G = puterea de marire (100 x,40 x, etc) a obiectivului

{E

din (2), se obtine d - v

Jr

din (3 t se obtine d =

J[

GK

(4) Se numără celulele fluorescente tipice pe câmp (c).

Se calculează numărul celulelor fluorescente tipice pe godeu (C).

s

C=C- s

Se calculează numărul celulelor fluorescente tipice pe ml de depozit (N).

N =

CxIOOO xF

y

unde y = volumul depozitului pe godeu, unde F = factorul de diluție a depozitului.

Apendicele 5

CULTURA VINETELOR

Se însămânțează semințe de vânătă (Solanum melongena cv. Black Beauty) într-un compost pasteurizat pentru semințe. Se planteaza plantulele cu cotiledoane complet dezvoltate (10-14 zile) intr-un compost pasteurizat pentru ghivece.

Se utilizează vinete în stadiu de trei frunze, atunci când cel putin două dar nu mai mult de trei frunze sunt desfăcute complet.

Vinetele trebuie să fie cultivate în sera, în următoarele condiții:

durata zilei: temperatura:

14 ore de lumină naturală sau mai mult; ziua: 21 până la 24° C,

noaptea: 15° C.

N.B.: C.m. ssp. sepedonicus nu crește la temperaturi de peste 30° C. Dacă temperaturile nocturne nu scad la 15 ° C se poate produce deteriorarea cromoforului (necroza argintie).

Deteriorarea rădăcinii cauzate de larvele sciaride poate fi evitata prin aplicarea unui insecticid adecvat.

Vânăta Black Beauty poate fi obținută de la firmele următoare:

1. AB Hammenhogs Fro, 50-Hammenhog, S,veden;

2. HURST Seeds Ltd, Avenue Road, Witham, Essex CM8 2DX, England;

3. ASGRO Italia Sp A

Corso Lodi, 23, Milan;

4. KUPPER

Mitteldeutsche Samen GmbH, Hessenring 22,

D-3 7269 Eschwege.

Apendicele 6

MEDII PENTRU CREȘTEREA ȘI IZOLAREA LUI CM. SSP. SEPEDONICUS

Agar nutritiv (NA)

Agar nutritiv difco bacto în apă distilată la standardul producătorului. Se sterilizează prin autoclavare la 121 ° C timp de 15 minute.

Dextroză agar (NDA)

cu un conținut de 1 % D

glucoză (monohidrat). Se sterilizează prin autoclavare la 115 ° C timp de 20 minute.

Drojdie-glucoză-peptona agar (YPGA)

Extract de drojdie difco bacto (nr. 0127)

bacto Peptonă difco bacto (nr. 0118) D

- glucoză (monohidrat)

Agar purificat difco bacto (nr. 0560) Apă distilată

5g 10 g

15 b °

I litru

Se sterilizează 0,5 l de mediu prin autoclavare la 115 ° C timp de 20

de minute.

Mediu de extract de drojdie de săruri minerale (YGM)

Extract de drojdie difco bacto

D

- glucoză (monohidrat)

2,0 g

g

..,.- L,)

0,25 g

KH2PO4 0,25 g

MgSO4. 7H2O 0,1 g

MnSO4. H2O 0,015 g

NaCl 0,05 g

FeSO4. 7H2O 0,005 g

Agar purificat difco bacto 18 g

Apă distilată

I litru

Se sterili ează 0,5 l mediu prin autoclavare la 115 ° C timp de 20 de minute.

Apendicele 7

TESTE NUTRIȚIONALE ȘI FIZIOLOGICE PENTRU IDENTIFICAREA LUI C M.

SSP. SEPEDONICUS

Toate mediile trebuie să fie incubate la 21° C și se examinează după 6 zile. Dacă creșterea nu a avut loc, se incubează până la maximum 20 de zile.

- Testul oxidativ și fermentativ (Hugh și Leipson, 1953) - testul O/F.

Mediul de bază:

KCl

MgSO4_ 7H2O NH4H2PO4

Peptonă difco bacto

Agar purificat difco bacto D

-glucoză (monohidrat) Albastru de bromtimol Apă distilată

0,2 g

0,2 g

1,0 g

1,0 g

3,0 g

10,0 g

0,03 g

1 litru

Se amestecă și se ajustează la un pH de 7,0 până la 7,2 cu KOH lN.

Se distribuie cate 5 ml și 1 O ml în eprubeta de cultură Pyrex de 16 mm x 100 mm (capacitate 12 ml).

Se sterilizează prin autoclavare la 115° C timp de 1O minute

Se inoculează fiecare cultura prin intepare adanca in eprubeta ge 5 si l O ml. In mod antiseptic, se adaugă 1 până la 2 ml parafină lichidă sterilă in eprubeta de 1 O ml. Se incubează.

Reacție pozitivă:

Tub

Culoare

Interpretare

Deschis

Galben

Fermentativă Oxidativă Oxidativă sau inertă

Închis

Galben

Deschis

Galben ·

Închis

Verde-albastru

Deschis

Verzui

Închis

Verde-albastru

- Testul oxidazei (Kovacs, 1956) Reactivul h1i K9vacs pentru testul oxidazei: Soluție apoasă de dihidroclorură de tetrametil parafenilenediamin (BDH nr. 30386) 1 % în apă distilată.

Acest reactiv trebuie să fie preparat proaspăt în volume de 1 ml sau poate fi conservat într-o sticlă maronie la 5 ° C timp de 1 până la patru săptămâni. Se pune o picătură de reactiv pe o hartie de filtru într-un vas Petri curat. Se rade imediat o parte din cultura de testare de pe agarul nutritiv utilizând o ansa de platină.

Reacție pozitivă: Apare o colorație purpurie în termen de 1 O secunde. Culturile pentru care coloratia apare intr-un timp de 10 până la 30 de secunde sunt slab pozitive.

N.B.: Este esențial să se utilizeze o ansa de platină și culturi NA deoarece urmele de fier sau continutul ridicat de zahăr din mediul de creștere pot da rezultate pozit ' ive false. - Producția de acid din lactoză, ramnoză, salicina, glicerol.

Se prepară un mediu Hugh și Leifson O/F fără glucoză. Se - distribuie cate 5 ml în eprubete. Se sterilizează prin autoclavare la 115 ° C timp

de 10 minute. In procesul de topire, cand baza atinge 45°C, se adaug in mod aseptic, 0,5 ml de soluție apoasa 1O %, sterilizata prin filtrare, fie de glicerol, lactoză, ramnoză sau salicina. Se amestecă cu grijă.

Reacție pozitivă: Schimbarea culorii din verde-albastru în galben indică producerea acidului. - Testul catalazei

Se pune o picătură de peroxid de hidrogen (30 de volume) pe o lama curată și se emulsifiaza adaugand continutul unei anse de platina de cultura.

Reactie pozitiva: Producerea de bule de oxigen indică prezența catalazei. - Reductaza nitratului și denitrificarea (Bradbury, 1970) Mediu de cultură: KNO 3 (fără nitrit)

lg Extract de drojdie difco bacto K2HPO4 5 g Apă distilată

lg 1 litru

Se dozează cate 1O ml în sticle de 20 ml. Se sterilizează prin autoclavare la 121° C timp de 15 minute. Reactiv A: 8g

Acid acetic 5N Reactiv B: Naftilamină 1 litru 5g

Acid acetic 5N 1 litru Se inoculează mediul de nitrat în duplicat. Se testează după 1O și 20 de zile adăugând o picătură de iod Lugol, 0,5 ml reactiv A și 0,5 ml reactiv B. Dacă mediul nu devine roșiatic, se adaugă aproximativ 50 mg pudră de zinc. Se observă reacția culorii.

Reacția pozitivă:

Nici o reducere de nitrat Reducerea nitratului până la nitrit (numai reductaza nitratului) Reac, tia culorii Etapa 1 incolor

roșu

Etapa2 roșu Reducerea nitratului peste nitrit (denitrificare - reductaza nitratului și nitritului) incolor

incolor - Producția de urează (Lelliott, 1966) Mediu de cultura:

Bază de uree oxoid agar (CM53) Apă distilată

2,4 g

95 ml

Se sterilizează prin autoclavare la 115° C timp de 20 de minute. Se răcește baza topită pana la 50° C și se adaugă, in mod antiseptic, 5 ml de soluție de uree apoasă 40 % (oxoid SR20) sterilizată prin filtrare. Se amestecă bine.

Se dozează cate 6 ml în eprubete sterile (16 x 100 mm) și se lasă să se-depună în pantă.

Reacție pozitivă: Mediul galben-portocaliu capătă o colorație roșie

vișinie sau roz fucsină, dacă s-a produs o urează. Utilizarea citratului (Christensen) (Skennan, 1967)

Bază de citrat agar (Merck 2503) Apă distilată

23 g

1 litru

Se amestecă și se dizolvă prin încălzire. Se dozează cate 6 ml, ca pentru mediul testului de producerii a ureazei. Se sterilizează prin autoclavare la 121° C timp de 15 de minute și se Iasă să se depună în pantă.

Reacție pozitivă: Utilizarea citratului este indicată printr-o reacție de schimbare a culorii mediului din portocaliu în roșu.

- Producția de sulfură de hidrogen (Rarnarnurthi, 1959) Mediu:

Tripton difco bacto (nr. O123) 1O g

N l 5g

Apă distilată 1 litru

Se dizolvă și se dozează cate 6 ml în eprubete de 16 x I00 mm. Se sterilizează prin autoclavare la 115° C timp de IO de minute.

Se inoculează. La gura eprubetei, in mod aseptic, se pune o hârtie de acetat de_plumb (Merck 9511) Se fixează cu capacul. Se incubează timp de maximum douăzeci de zile.

Reacție pozitivă: Producerea H 2 S din tripton este indicată prin colorarea negru maronie a hârtiei reactive.

- Producere de indol (Ramamurthti 1959)

Mediu:

Ca și pentru testul H 2 S..

Se îndepărtează hârtia de acetat de plumb și se adaugă 1 până la 2 ml de eter dietilic și se agită ușor. Se lasă la decantat (5 min). Se adaugă 0,5 ml de reactiv Kovacs (Merck 9293) în eprubeta înclinat.

Reactie pozitiva: Prezenta indolului este indicată prin apariția unei culori roșii în

stratul galben dintre eter și faza apoasa.

- Creștere la 37 ° C (Ramamurthi, 1959) Mediu:

Amestec nutritiv bacto difco NaCI

Apă distilată

8g 70 g

1 litru

Se amestecă, se dizolvă și se dozează cate 6 ml în eprubete.

Se sterilizează prin autoclavare la 121° C timp de 15 de minute. Se inoculează și se incubează la 37 ° C.

Reacție pozitivă: Se urmărește creșterea.

- Creșterea în clorură de sodiu 7 % (Ramamurthi, 1959) Mediu:

Amestec_nutritiv difco bacto NaCl

Apă distilată

8g 70 g

1 litru

Se amestecă, se di olvă și se dozează cate 6 ml în eprubete.

Sterilizați prin autoclavare la 121 ° C timp de 15 minute.

Reacție pozitivă: Se urmărește creșterea.

- Hidroliza gelatinei (Lelliot, Billing & Hayward, 1966)

Mediu:

Gelatină difco bacto (nr. 0143) Apă distilată

120 g

1 litru

Se amestecă, se dizolvă prin încălzire și se dozează cate 6 ml în eprubete.

Se sterilizează prin autoclavare la 121° C timp de 15 de minute.

Reacție pozitivă: Lichefierea gelatinei chiar dacă temperatura ramane de la 5° C timp de 30 de minute.

- Hidroliza amidonului Mediu:

Agar nutritiv bacto difco (topit)

.Amidon solubil bacto difco (nr.

0178)

1 litru

2g

Se amestecă și se sterilizează prin autoclavare la 115° C timp de 1O

-de minute.

Se toarnă în vase. Se inoculeaza vasele in spoturi.

Dacă se constată o creștere bună (10 până la 20 de zile), se preleveaza - o parte · din produs și se imersează în iod Lugol.

Reactie pozitiva: Hidroliza amidonului este indicată prin zone

limpezi, sub sau în jurul creșterii bacteriene; restul mediului se colorează în purpuriu.

- Hidrolaza esculinei (Sneath & Collins, 1974) Mediu:

Peptonă bacto difco Esculină

Citrat feric (Merck 3862)

Citrat de sodiu Apă distilată

10 g

lg

0,05 g

I g

1 litru

Se dizolva prin amestecare și se dozează cate 6 ml în eprubete. Se sterilizează în autoclavă la 115° C timp de IO de minute.

Mediul este limpede, cu o fluorescență albăstruie.

Reacție pozitivă: Hidroliza esculinei este indicată prin apariția unei culori maro si dispariția fluorescenței. Aceasta poate fi controlată utilizând o lampă cu raze ultraviolete.

PARTEAB

Pentru materialul listat în anexele 2 și 4 ale Hotărârii Guvernului numarul 1030/2001 privind măsurile de protecție împotriva introducerii și răspândirii organismelor de carantină dăunătoare plantelor sau produselor vegetale în România.

1.a)

Măsurile oficiale de carantină includ inspecția adecvată sau testarea pentru organismele dăunătoare relevante listate în Anexele 1 și 2 ale Hotărârii Guvernului numarul 1030/2001 privind măsurile de protecție împotriva introducerii și răspândirii organismelor de carantină dăunătoare plantelor sau produselor vegetale în România și sunt luate în conformitate cu exigentele specifice menționate în Anexa 4 a Hotărârii Guvernului numarul 1030/2001 privind măsurile de protecție împotriva introducerii și răspândirii organismelor de carantină dăunătoare plantelor sau produselor vegetale în România pentru organismele dăunătoare specifice,

b) Pentru respectarea exigențelor specifice, metodele folosite pentru măsurile de carantină sunt cele prevăzute în Anexa 4 a Hotărârii Guvernului numarul 1030/2001 privind măsurile de protecție împotriva introducerii și răspândirii organismelor de carantină dăunătoare plantelor sau produselor vegetale în România, sau alte măsuri echivalente adecvate aprobate oficial.

2. Materialul trebuie să fie găsit liber, în conformitate cu prevederile paragrafulu 1, de organisme dăunătoare relevante specificate în anexele 1, 2 și 4 ale Hotărârii Guvernului numarul 1030/2001 privind măsurile de protecție împotriva introducerii și răspândirii organismelor de carantină dăunătoare plantelor sau produselor vegetale în RQmânia.

Regia Autonomă

e>r1i te>rt.il C>ficia.1

în pas cu timpul

Centrul pentru relații cu publicul

Șos. Panduri nr. 1, bloc P33, parter, sector 5, București

PROMPT, COMOD,

MODERN ȘI UȘOR DE UTILIZAT

Prompt, comod, modern - prin procurarea electronică a Monitorului Oficial al României atât în sistem abonament, cât și selectiv, a anumitor numere ale Monitorului Oficial al României sau acte normative.

OPERATIVITATE

Tel.: 411.58.33

Fax: 410.77.36

E-mail:

multimedia@ramo.ro Website:

www.monitoruloficial.ro

, Î.ic:: Șij dițiile în care disp

<i8RW3;'aloarea

r,restație re,gµ ț fe de 20 1/o

pen redu. { ț e, de 40% pen

Cu

aJ Jî i: '}Ilui „motor

aferent ârifil @ fl Q03) se

poate re perioada 2Z'clefțți:i:J2-9.J; 1989

până la

zi,

combinație de crit e fii '. il J;;}:;;lH; p răspuns

r;: !J !: 0 Jfufjea::tțff.

care a fost publicat,

·••••• • r • i • e •• t • a •• t • e •• a • • s •• t • a • r •• u • • l • u • i • • * •. •••

, 2,

2,4 5,4

Abonament pe anul 2003 la Monitorul Ofici

Partea I, în limba maghiară - 120 EUR.

Abonament pe anul 2003 la Monitorul Oficial

Partea a II-a - Dezbateri parlamentare - 192 E

.

Abonament pe anul 2003 la Monitorul Oficial al R,

Partea a III-a - Publicații și anunțuri - 60 EUR.

Abonament pe anul 2003 la Monitorul Oficial al Romaruet, ·'i{{sJJ Partea a IV-a - Publicații ale agenților economici - 228 EUR. ·,. - Abonament pe anul 2003 la Monitorul Oficial al României,,,2

Partea a VI-a - Achiziții publice - 192 EUR.

Vol.46-. 3,2 7,1 7,8

Prin aceleași mijloace multimedia (e-mail, CD, dischete):

Vol.47-Aslg':liăriși easigurăriînRomarua

0,6 1,,2 1 1 1 Vol.48-Fondul funciar*

7,2 b,31'1,8

Vol.49 - lementări privind locuințl!*

..

..

. 3,3 7,1 6,8

•

colectia electronică a Monitorului Oficial,

Partea

I și

Voi.SO-Alegeri patlanîentare și preztden ale*

.3,8 8,2 8,2 Parte I bis (numere incluse în abonament)

Vol.51 - Societatea Română de Radiodifuziune și Societatea Română 1989-2002 (319 EUR)

Vol.52- t ·și po I p o; ·:::::::::::::::-ii s Ț 2 1 2

l;! H •

selecții Monitorul Oficial, Partea I, Partea a II-a, Partea a III-a,

Vol.53 -!kg! tan pnvm cqrupțta șt orgaruzara....

.

.:. ····:i;····

. 1,3 2,8 2,8 Partea a IV-a, Partea a V-a, Partea a VI-a (0,08 EUR/pag.)

l: Jt jl !fu ci -.....:::::Ji

l, 4 •

versiunea

electronică a lucrării "Actele publicate în Monitorul

Vol.56 -Adminiț;trația_pu licălocală*

4,1 8) 8)

Oficial al României, Partea I - 22 dec. 1989 - Vol.57 - Proțe!:țta cop.ifulU1 5,6 1tf 1\6

31 ian. 2003" - lucrare ce cuprinde titlurile actelor normative

Vol.S 8 • Codul munru

3, 2 6, 6,

Vol.59 - la e privind notarii publici. 6,2

publicate în perioada menționată, cuindicarea actelor normative

Vol.60 - Re_gle;n tări privjnd întrepripd ril mici și mijlocii

ce au adus modificări și/sau completări (15 EUR). -Societaµcomerciale-cadrumsuruµonal 4,6 10,1 9,4

Vol.61 - R<;_gle entări pțivind.întreprinderije mici și mijlocii

- l!Jreglstr ea ș1 _aut<;_>nzar coll).er ților ··.:·····::·..····:······:·

..4,8 9,8 9 1 8

6,4

Preturile includ T.V.A.

Plata se face în iei, la cursul de schimb (B.N.R.) din ziua efectuării plății.

Vol.62 - Reglementăn pnvmd tntrepnnderile !11lO

ș1 l111Jlocu - Ftscalitatea

6 12 l1,9

* Aceste lucrări conțin acte normative care au fost ulterior modificate și/sau abrogate.

P

R

E

Ț

U

R

I

L

E

publicațiilor

legislative

pentru

anul 2003

- pe

suport

tradițional -

Nr.

Nr.

crt.

Denumirea

publicației

anual de

apariții

Valoarea

abonamentului

anual - lei -

Trim.

I

Valoarea

abonamentului

trimestrial - lei -

Trim.

II

Trim.

III

Trim.

IV

1. Monitorul

Oficial,

Partea

I,

în

limba

română 710 7.900.000 1.975.000 2.172.500 2.389.750 2.628.750

2. Monitorul

Oficial,

Partea

I,

în

limba

română,

numere

bis*) 50 1.480.000 - - - - 3. Monitorul

Oficial,

Partea

I,

în

limba

maghiară 250 6.585.000 1.646.250 1.646.250 1.646.250 1.646.250

4. Monitorul

Oficial,

Partea

a

II-a 300 10.380.000 2.595.000 2.595.000 2.595.000 2.595.000

5. Monitorul

Oficial,

Partea

a

III-a 700 2.105.000 526.250 526.250 526.250 526.250

6. Monitorul

Oficial,

Partea

a

IV-a 2.100 8.900.000 2.225.000 2.225.000 2.225.000 2.225.000

7. Monitorul

Oficial,

Partea

a

VI-a 250 8.195.000 2.048.750 2.048.750 2.048.750 2.048.750

8. Colecția

Legislația

României 4 2.070.000 517.500 569.250 626.150 688.750

9. Colecția

de

hotărâri

ale

Guvernului

și

alte

acte

normative 12 3.450.000 862.500 948.750 1.043.600 1.147.950

10. Repertoriul

actelor

normative 1 520.000 - - - - 11. Decizii

ale

Curții

Constituționale 1 390.000 - - - - 12. Ediții

trilingve 12 2.075.000 - - - - *)

Cu

excepția

numerelor

bis

în

care

se

publică

acte

cu

un

volum

extins

și

care

interesează

doar

un

număr

restrâns

de

utilizatori.

Publicațiile

Regiei

Autonome „Monitorul

Oficial"

menționate

la

punctele 1-7

sunt

purtătoare

de

T.V.A.

în

cotă

de 19%,

iar

cele

menționate

la

punctele 8-12

sunt

scutite

de

T.V.A.

Pentru

siguranța

clienților,

abonamentele

la

publicațiile

Regiei

Autonome „Monitorul

Oficial"

se

pot

efectua

prin

următorii

difuzori:

◆ COMPANIA

NAȚIONALĂ „POȘTA

ROMÂNĂ" - S.A. -

prin

oficiile

sale

poștale ◆

RODIPET - S.A. -

prin

toate

filialele ◆

INTERPRESS

SPORT - S.R.L. -

București,

str.

Hristo

Botev

nr. 6 (telefon/fax: 313.85.07; 313.85.08; 313.85.09) ◆

PRESS

EXPRES - S.R.L. -

Otopeni,

str.

Flori

de

Câmp

nr. 9 (telefon/fax: 772.66.87; 0745.133.712) ◆

M.T.

PRESS

IMPEX - S.R.L. -

București,

bd.

Basarabia

nr. 256 (telefon/fax: 255.48.15; 255.48.16) ◆

INFO

EUROTRADING - S.A. -

București,

Splaiul

Independenței

nr.202A (telefon/fax: 212.73.54) ◆

ZIRKON

MEDIA - S.R.L. -

București,

bd.

Nicolae

Grigorescu

nr. 29A,

bl.

N22,

ap. 38 (telefon/fax: 340.31.09) ◆

ACTA

LEGIS - S.R.L. -

București,

str.

Banul

Udrea

nr. 10, (telefon/fax: 411.91.79) ◆

CURIER

PRESS - S.R.L. -

Brașov,

str.

Traian

Grozăvescu

nr. 7 (telefon/fax: 0268/47.05.96) ◆

ELIDA - S.R.L. -

Brașov,

str.

Bisericii

Române

nr. 92 (telefon/fax: 0268/47.74.64) ◆

MIMPEX - S.R.L. -

Hunedoara,

str.

Ion

Creangă

nr. 2,

bl. 2,

ap. 1 (telefon/fax: 0254/71.92.43) ◆

CALLIOPE - S.R.L. -

Ploiești,

str.

Candiano

Popescu

nr. 36 (telefon/fax: 0244/51.40.52, 0244/51.48.01)